FXR1P蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的鑒定及相關(guān)小分子RNA的篩選.pdf

1、脆性 X綜合征是最常見的遺傳性智力低下疾病之一,由 FMR1編碼產(chǎn)物FMRP的表達(dá)下降或缺失引發(fā)疾病。FXR1與FMR1有高度的序列及結(jié)構(gòu)相似性,屬于脆性X基因家族。FXR1編碼產(chǎn)物FXR1P與FMRP在氨基酸序列上具有極高的同源性,屬于脆性X蛋白家族。FXR1P是一種對(duì)于神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)發(fā)育有重要調(diào)控作用的蛋白,具有RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合功能。FXR1P蛋白及RNAs結(jié)合特性研究在一定程度上有助于了解FXR1P的調(diào)節(jié)機(jī)制及其基本功能,進(jìn)而明

2、確FXR1P與脆性X綜合征發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。
　　目的:1用FXR1P與CMAS這對(duì)經(jīng)驗(yàn)證有相互作用蛋白質(zhì),對(duì)FXR1P分子內(nèi)的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定,研究FXR1P的蛋白結(jié)合特性,揭示FXR1P與蛋白質(zhì)相互作用的分子機(jī)制。2對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中的FXR1P與小分子RNA結(jié)合情況進(jìn)行研究,篩選可與FXR1P相互作用的小分子RNAs,鑒定其種類,探索 FXR1P與小分子RNAs之間的關(guān)系,揭示 FXR1P調(diào)節(jié)目標(biāo)mRN

3、A的分子機(jī)制。
　　方法:1利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在線分析工具 PDB數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì) FXR1P分子進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)FXR1P的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增可表達(dá)包含不同結(jié)構(gòu)域FXR1P分子的基因,產(chǎn)物構(gòu)建到pGBKT7載體,酵母雙雜交鑒定表達(dá)產(chǎn)物與CMAS的相互作用情況,確定相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。2利用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù),在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤 SH-SY5Y細(xì)胞中篩選與 FXR1P有相互作用的小分子RNAs,3'和5'端加特定接頭后逆轉(zhuǎn)錄

4、為cDNA單鏈,設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,回收PCR產(chǎn)物后連接至T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序,生物信息學(xué)分析確定小分子RNA種類。
　　結(jié)果:1成功構(gòu)建了pGBKT7-FXR1Δ402和pGBKT7-FXR1Δ450兩種表達(dá)不同N端FXR1P的重組質(zhì)粒,經(jīng)檢測(cè)無自激活性;酵母雙雜交結(jié)果顯示,FXR1P N端第134–150之間的17個(gè)氨基酸殘基是與CMAS相互作用的關(guān)鍵區(qū)域;2利用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù),從SH