利用PNA-PCR法早期檢測乙型病毒性肝炎YMDD耐藥變異.pdf

1、抗病毒治療是慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）治療的關(guān)鍵。目前應(yīng)用于抗病毒治療的藥物主要分為兩大類:核苷（酸）類似物和干擾素。拉米夫定(LAM，lamivudine)是第一個被批準(zhǔn)用于慢性乙型病毒性肝炎治療的藥物，它能夠有效的抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制，可以顯著的降低血清中HBVDNA(hepatitis B virus DNA)的水平，促進(jìn)HBeAg(hepatitis Be antigen)的血清學(xué)轉(zhuǎn)換

2、，改善肝臟的炎癥活動，延緩或阻止肝臟疾病的進(jìn)展，降低肝癌(HCC，Hepatocellular carcinoma)的發(fā)生率。由于其相對較低的價格，拉米夫定仍然是很多病人進(jìn)行抗病毒治療的首選藥物，特別是在發(fā)展中國家。但是長期治療過程中產(chǎn)生耐藥是抗病毒治療的一個難題。拉米夫定治療一年的基因耐藥率是14-32％，治療2年、3年和4年后分別上升到38％、49％和66％。有些病人在出現(xiàn)病毒學(xué)突破后發(fā)生肝炎的急性惡化，導(dǎo)致肝臟失代償，甚至是死亡。

3、耐藥后繼續(xù)拉米夫定的治療將不能獲得臨床益處。拉米夫定耐藥性的產(chǎn)生主要與HBV P基因逆轉(zhuǎn)錄(RT)酶區(qū)突變有關(guān)，這些突變位點(diǎn)大部分位于204位點(diǎn)即YMDD（酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸）基因序列，YMDD基因序列位于DNA聚合酶中心部位，是酶的催化區(qū)，與核苷酸的親和力高，主要的改變是YMDD中M（蛋氨酸）被V（纈氨酸）成為YVDD(rtM204V)或是YMDD中的M（蛋氨酸）被I（異亮氨酸）取代，成為YIDD(rtM204I)也有

4、少部分位于180位點(diǎn)L（亮氨酸）變?yōu)镸（蛋氨酸）。另外還有相關(guān)研究表明，YMDD變異還會影響其他核苷（酸）類似物的藥效，因?yàn)橛泄餐哪退幬稽c(diǎn)的緣故，還有可能會引起其他抗病毒藥物（如恩替卡韋）的耐藥，對于已經(jīng)發(fā)生了rtM204V/I變異的患者，我們應(yīng)該謹(jǐn)慎的選擇治療方案。YMDD變異的產(chǎn)生使得HBV DNA聚合酶的活性降低，所以新產(chǎn)生的突變的準(zhǔn)種的復(fù)制能力低于野生株，屬于非優(yōu)勢株，但是隨著抗病毒藥物的應(yīng)用，在抗病毒藥物及機(jī)體免疫力的作用下

5、野生株即優(yōu)勢株的的復(fù)制能力逐漸被抗病毒藥物抑制，復(fù)制能力降低，野生株的數(shù)量逐漸減少甚至消失，剩余的變異的突變株轉(zhuǎn)為優(yōu)勢株，但是因?yàn)檫@種變異株的聚合酶區(qū)發(fā)生突變，拉米夫定對這種變異株的復(fù)制沒有抑制作用，變異的病毒開始繼續(xù)復(fù)制，隨著復(fù)制的進(jìn)行，逐漸占主導(dǎo)地位，使患者體內(nèi)的病毒數(shù)量激增，導(dǎo)致患者HBV-DNA和ALT的水平出現(xiàn)反彈。因此YMDD變異的快速檢測對于及早發(fā)現(xiàn)耐藥變異、避免耐藥的發(fā)生、對患者實(shí)施個體化治療方案具有重要意義。
　

6、　 目前用于臨床耐藥檢測的方法有很多種，PCR產(chǎn)物直接測序法(direct PCRsequencing)，PCR產(chǎn)物克隆測序法，聚合酶-限制性片段長度多態(tài)性，反向雜交法(reverse hybridization assay)，基因芯片(gene chip)，限制片段質(zhì)譜多態(tài)性技術(shù)（restriction fragment mass polymorphism，RFMP）等，目前被大家公認(rèn)的耐藥檢測的是PCR產(chǎn)物直接測序法，Keefff

7、e等認(rèn)為PCR產(chǎn)物直接測序法應(yīng)作為基因型耐藥檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。但是該方法的靈敏度低，最低檢測限為20％，即突變株數(shù)量需達(dá)到整個病毒群的20％時，才能檢測到。因?yàn)榇嬖谶@種缺陷，所以不能盡早發(fā)現(xiàn)病人的耐藥突變，所以需要一種靈敏性及特異性高的方法來及早發(fā)現(xiàn)突變來治療病人的臨床用藥。
　　 PNA(peptide nucleic acid，PNA)即肽核酸是于1991年由哥本哈根大學(xué)的Riso實(shí)驗(yàn)室的丹麥科學(xué)家Nielsen等首先設(shè)計合成。

8、PNA的骨架由重復(fù)排列的N-(2-氨乙基)甘氨酸單位通過酰胺鍵連接而成，嘌呤和嘧啶堿基通過亞甲基羰基連接于骨架的氨基N上，由于不含有磷酸基團(tuán)，故不帶電，為中性，與靶序列雜交時排斥力很小，形成的復(fù)合物非常穩(wěn)定。PNA的特性主要包括一下幾方面:1、PNA與DNA單鏈或RNA雜交體(PNA/DNA)的穩(wěn)定性較高:與相應(yīng)DNA雙鏈相比，每增加一個堿基對，PNA/DNA解鏈的Tm值將增加1℃(0.1mol/l的NaCl中)。例如，一15堿基對DN

9、A雙鏈的解鏈溫度為54℃，相應(yīng)PNA/DNA的解鏈溫度就達(dá)到69℃。2、復(fù)合物的穩(wěn)定性不受鹽濃度的影響:PNA/DNA雜交形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與介質(zhì)的鹽濃度無關(guān)。在鹽離子強(qiáng)度較低時，PNA能與靶序列的單鏈DNA分子雜交，形成穩(wěn)定的復(fù)合物并且復(fù)合物的Tm值較高。PNA/DNA、PNA/RNA的結(jié)合比相應(yīng)DNA/DNA、DNA/RNA的結(jié)合更穩(wěn)定，這是由PNA和DNA鏈之間缺乏靜電排斥所致。在低離子強(qiáng)度環(huán)境下，特別是在無Mg2+環(huán)境中，

10、PNA也能與DNA雜交。利用這一特性，可通過適當(dāng)調(diào)整介質(zhì)的離子濃度設(shè)計PNA探針，與標(biāo)本中的DNA或PNA雜交，這一應(yīng)用主要是用于靶序列中點(diǎn)突變的檢測。3、PNA與互補(bǔ)DNA雜交結(jié)合時有很高的專一性，PNA/DNA堿基錯配雜交分子的不穩(wěn)定性比DNA/DNA堿基錯配雜交分子的不穩(wěn)定性更高。例如:在混合的PNA/DNA雜交分子中，如果15個堿基對中有一對錯配，則其解鏈溫度(Tm)下降8-20℃（平均降低15℃），兩對堿基錯配則完全不能雜交，

11、而相應(yīng)的DNA/DNA雜交分子中，一個堿基對配錯，解鏈溫度只降低4-16℃，（平均降度11℃）。因此，與DNA探針相比，較短的PNA探針可以進(jìn)一步提高探針雜交的專一性。本研究正是利用PNA的這些特性，設(shè)計出針對HBV YMDD野生株的PNA探針。PNA探針與靶DNA單鏈結(jié)合后穩(wěn)定性高，且解鏈溫度高。如果在PCR反應(yīng)中加入PNA探針，YMDD野生株DNA/PNA雜交體由于完全配對而具有較高的解鏈溫度;而變異株的DNA/PNA雜交體由于存在

12、一個堿基的不配對而具有較低解鏈溫度。設(shè)計PCR的復(fù)性溫度高于變異株DNA/PNA雜交體的解鏈溫度，而高于野生株DNA/PNA雜交體的解鏈溫度;就能抑制YMDD野生株的擴(kuò)增，從而選擇性的擴(kuò)增變異株。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　 1.本研究擬建立一種更加靈敏的檢測HBV YMDD突變的方法-PNA-PCR法，通過該方法檢測已知病毒含量的不同比例混合的質(zhì)粒的突變，與直接測序法相比較，驗(yàn)證新方法的靈敏性及特異性。
　　 2.通

13、過對臨床核苷類藥物治療的病人耐藥檢測以及未治療的慢性乙型病毒性肝炎患者預(yù)存耐藥的檢測，驗(yàn)證新方法在抗病毒治療過程中耐藥檢測的優(yōu)勢。
　　 材料與方法
　　 1.樣本來源:選用100例南方醫(yī)院2011年3-5月門診測序病人的標(biāo)本，上述患者均接受拉米夫定治療且臨床懷疑或檢測耐藥，另外收集100例南方醫(yī)院感染內(nèi)科門診2012年7月-11月未使用核苷（酸）類藥物治療的患者血清，及20例健康獻(xiàn)血者的血清，上述患者HBeAg陽性或陰

14、性，無HIV, HCV, HDV等感染史，收集所有患者血清，儲存于-30℃。
　　 2.HBV DNA提取:收集患者血清，使用凱杰公司的QIAamp DNA Blood MiniKit，根據(jù)操作說明從200μl血清中提取HBV DNA用于下一步操作。
　　 3.HBV DNA逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(Reverse Transcriptase region，RT)擴(kuò)增:分別使用直接測序法及PNA-PCR法對HBV RT區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，直接

15、測序法的產(chǎn)物送測序，PNA-PCR法的結(jié)果直接是用瓊脂糖凝膠電泳法來觀察。
　　 4(,。)統(tǒng)計學(xué)分析:所有的數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，率的比較用x2檢驗(yàn)，P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.新的耐藥檢測的方法PNA-PCR法的靈敏性及特異性與臨床常規(guī)測序方法的比較評價:在病毒含量較低的情況下，直接測序法只能檢測到10％的突變，而PNA-PCR法則可以檢測到0.01％

16、的突變，檢測的靈敏性提高1000倍;在病毒含量較高的情況下，直接測序法可以檢測到0.01％的突變，PNA-PCR法可以檢測到0.001％的突變，檢測的靈敏性提高10倍?？傊苯訙y序法相比PNA-PCR法可以將耐藥突變檢測的靈敏性提高10～1000倍。
　　 2.PNA-PCR法在臨床耐藥檢測中的應(yīng)用:
　　 (1).使用核苷（酸）類似物治療的患者HBV YMDD耐藥的檢測:在100例患者中有15例患者結(jié)果為PCR陰性，

17、剩余85例患者用直接測序法檢測突變的結(jié)果為34例（YIDD為21例，YVDD為11例，YIDD+YVDD為2例），陽性率為40.0％。PNA-PCR法檢測突變結(jié)果為73例（YIDD為40例，YVDD為23例，YIDD+YVDD為10例），陽性率為85.9％，較直接測序法檢測的靈敏度大幅度提高。
　　 (2)未使用核苷（酸）類似物治療的患者HBV YMDD耐藥檢測:在100例未經(jīng)核苷（酸）類似物治療的患者中有21例患者使用PNA-

18、PCR法檢測出存在YMDD自然突變陽性率為21％,20例健康獻(xiàn)血者的血清分別使用PNA-PCR法及PCR產(chǎn)物直接測序法檢驗(yàn)，均未檢測到乙肝病毒，兩種方法的特異性好，未出現(xiàn)假陽性。
　　 結(jié)論：
　　 1、PNA-PCR法在檢測乙肝病毒YMDD耐藥突變種具有較高的靈敏性及特異性，尤其是在血清低病毒拷貝是，與直接測序法相比，PNA-PCR法具有更高的靈敏性，檢測差異明顯;
　　 2、PNA-PCR PNA-PCR法可