大、小鼠卵泡培養(yǎng)方法及其在雌性生殖毒性研究中的應用.pdf

1、生殖和發(fā)育功能障礙是當前嚴重影響人體健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。外源性化學物作用于雌性生殖系統(tǒng)可以導致卵巢周期紊亂或不育,致使人群中自發(fā)性流產率、子代發(fā)育異常、生育力下降等顯著增加。同時,雌性所有的配子在出生前就已經(jīng)形成,出生時卵泡的數(shù)量是固定的,如果破壞了,無額外的配子補償,后果較雄性更嚴重。因此,篩選和鑒定具有雌性生殖毒性的化學物,闡明其毒作用機制,對防治化學物引起的生殖系統(tǒng)危害具有重要意義。 近年來由于組合化學、計算機輔助

2、藥物設計等的快速發(fā)展帶來新化學物的快速增長,現(xiàn)有毒理學評價方法已遠遠不能滿足化學物快速增長的需求。因此,國際上的發(fā)展趨勢是在方法學上要求發(fā)展符合“4R"原則(替代、減少、優(yōu)化和可靠性)、具有高通量、所需受試樣品量少的試驗方法。目前雌性生殖毒性評價方法主要采用體內試驗,存在的主要問題是整體動物實驗不敏感、周期長、所需受試樣品量多。體內試驗難以揭示毒作用位點和毒作用機制。為此,近幾年國內外已經(jīng)建立了多種體外雌性生殖毒性試驗方法,包括卵巢器官

3、和卵巢皮質薄片培養(yǎng)方法和大鼠顆粒細胞和黃體細胞體外毒性試驗方法。但這些體外方法無法對卵泡發(fā)育和卵子生成做出客觀評價,而這應是雌性生殖毒性研究的關鍵所在。因此,迫切需要發(fā)展既能快速檢測雌性生殖毒性又能更好地研究其作用機制的新方法。 卵泡體外培養(yǎng)方法是近年來發(fā)展的將早期卵泡不成熟卵母細胞(GV期或GV前期)在體外發(fā)育到可正常受精的成熟卵母細胞(MII)的方法。由于該方法能對卵巢的主要功能即卵泡發(fā)育、激素生成和卵子發(fā)生進行動態(tài)觀察,可

4、在卵泡不同發(fā)育階段對卵泡每一組分進行分析,因此受到生殖生物學和生殖毒理學界的關注。目前國外已經(jīng)成功建立或基本建立綿羊、豬、小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)模型,并已應用于生殖生物學和生理學對卵泡發(fā)育和調控的研究。已有學者嘗試將小鼠模型用于生殖毒性研究,但尚未發(fā)展成為毒性試驗系統(tǒng)。有關大鼠腔前卵泡體外研究極少,僅見大鼠卵泡體外短期階段性培養(yǎng)的個別研究,目前國內外尚未見類似小鼠可比較完整地觀察大鼠卵泡發(fā)育過程和卵子形成的體外培養(yǎng)系統(tǒng)的報道。 本

5、研究擬借鑒國外的經(jīng)驗,首先建立小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法,在此基礎上嘗試建立大鼠腔前卵泡的體外培養(yǎng)方法；然后選擇已知卵巢毒物探討大小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法用于雌性生殖毒物鑒定和機制研究的可行性,目的是為建立一個既可對雌性生殖毒物進行篩選或鑒定,又可對生殖毒作用機制進行研究的體外毒性試驗系統(tǒng)提供依據(jù)。 一、小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法的建立 采用機械性方法分離出生后(post-natal day,PND)PND12～14(C57

6、81/6JxCBA/Ca)小鼠卵巢內直徑為100～130pun的腔前卵泡,96孔板單個卵泡在石蠟油覆蓋的M1培養(yǎng)基內連續(xù)培養(yǎng)12d后誘導排卵16h,觀察卵泡發(fā)育、激素分泌和卵子形成,并將體外卵母細胞的成熟情況與體內卵母細胞的生長情況(in vivo growth and in vitromaturation of oocytes,IVM)進行比較,以判斷體外培養(yǎng)方法是否成功。 1.小鼠卵泡體外發(fā)育特征 7只小鼠分離出41

7、9個卵泡,機械性分離完整卵泡率為376/419(89.74％),卵泡和卵母細胞直徑分別從118.51±10.40μm和50.75±1.67μm增加到培養(yǎng)d12的452.03±110.25μm和69.54±1.55μm;培養(yǎng)d12卵泡存活率為86.87％(364/419),有腔形成率為31.03％(130/419);誘導排卵后COCs排出率為50.60％(212/419)。 小鼠卵泡體外發(fā)育形態(tài)學變化：體外培養(yǎng)的部分卵泡經(jīng)歷從腔前

8、卵泡、有腔卵泡、排卵前卵泡、卵丘細胞-卵母細胞復合體(COCs)排出、卵母細胞成熟和極體排出的形態(tài)學變化,也有部分卵泡不發(fā)生腔樣結構改變,在卵泡中央可見卵丘-卵母細胞復合體,周圍顆粒細胞平鋪在培養(yǎng)板上,間隙不明顯。 2.小鼠卵泡體外激素分泌的變化 收集d10、d12、d13更換的培養(yǎng)基測定卵泡激素P,每個時間點收集1-3個樣品；收集d4、6、8、10、12更換的培養(yǎng)基測定卵泡激素E2。E2和P的檢測采用磁性酶聯(lián)免疫法,E

9、2抗體用17 β-oestradiol,質控管在600～900p/ml;P質控管在7～13ng/ml。體外培養(yǎng)卵泡從d4天開始檢測到E2增加,并且隨著培養(yǎng)時間延長持續(xù)增加,d10～12維持在較高水平；d12誘導排卵刺激后P分泌量急劇增加,體外培養(yǎng)卵泡分泌E2和P激素與體內分泌特征一致。 3.小鼠卵母細胞體外成熟 研究結果顯示,IVG組4.61％(10/217)卵母細胞不能恢復成熟(停止在Gv期),76.50％(166/2

10、17)停止減數(shù)分裂在GVBD期,18.89％(41/217)卵泡發(fā)出PB;而IVM組1.24％(3/241)的卵母細胞不能恢復成熟(停止在GV期),45.23％(109/241)停止減數(shù)分裂在GVBD,53.53％(41/241)卵泡發(fā)出PB;能完全成熟過渡到MII期(PB排出)卵母細胞的比例在各個試驗組之間有差異；沒有一個卵母細胞完全發(fā)育成染色體不分離的超倍體。 綜上可見,從卵泡發(fā)育、激素合成和卵母細胞成熟三方面顯示本研究建立

11、的小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法基本是成功的,與國內上海計生所汪玉寶等報道實驗結果基本-致,但本研究卵母細胞PB形成率低于國外Sun F等微滴三維培養(yǎng)結果,有待進一步優(yōu)化和完善培養(yǎng)體系。 二、大鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法的建立 1.大鼠卵泡體外培養(yǎng)條件的確定, 2.大鼠卵泡體外發(fā)育特征4只PND13 SD大鼠共分離出296個腔前卵泡。機械性分離完整卵泡率為96.28％(285/296),卵泡和卵母細胞直徑分別從141.26

12、±8.82μm和51.25±1.37μm增加到培養(yǎng)day11 543.21±131.11μm和70.48±2.89μm,培養(yǎng)d11卵泡存活率為92.23％(273/296),d6有腔形成率為67.91％(201/296),d11有腔形成率為75.67％(224/296),COCs排出率為44.93％(133/296)。 3.大鼠卵泡體外激素分泌情況收集D4、6、8、10、12更換的培養(yǎng)基測定。 三、大鼠卵泡體外方法作為毒

13、性檢測系統(tǒng)的初步驗證 由于本研究建立的小鼠卵泡體外培養(yǎng)方法在卵母細胞PB形成率上尚達不到國外水平,有待改進。另一方面,本研究建立的大鼠體外卵泡培養(yǎng)方法多項指標明顯較小鼠卵泡培養(yǎng)效果好,加上大鼠是生殖毒性實驗中最常使用的動物。因此,本研究在目前的條件下首先選擇大鼠卵泡體外培養(yǎng)方法用于化學物雌性生殖毒性及其機制的研究。 本研究選擇氯化鎘、DEHP、MEHP和噻氨酯噠唑Nocodazole四種卵巢毒物,根據(jù)受試物作用特征,觀察

14、其對大鼠卵泡的體外毒性。 1.氯化鎘 鎘是一種常見的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物,動物實驗表明鎘可干擾卵巢內分泌功能,使大鼠動情周期延長,卵巢組織形態(tài)結構發(fā)生改變；可以抑制卵泡的正常生長發(fā)育,抑制雌性動物排卵,造成暫時性不育；可以通過促使體內顆粒細胞凋亡而誘導卵泡閉鎖,進而對卵母細胞的成熟、排卵等造成影響。體外實驗表明氯化鎘可以抑制大鼠顆粒細胞孕酮的合成。本研究從氯化鎘對卵泡發(fā)育、激素合成和不同發(fā)育階段卵泡的影響三個方面研究氯化

15、鎘的卵巢毒性及其可能的作用機制。 2.鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)和鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHF) DEHP和MEHP屬于鄰苯二甲酸酯類。動物實驗發(fā)現(xiàn)DEHP的雌性生殖毒性作用主要是通過其代謝產物MEHP影響卵巢功能,作用位點主要是卵巢顆粒細胞。 3.噻氨酯噠唑(Nocodazole) 噻氨酯噠唑是一種干擾微管組裝合成的抗腫瘤藥物。和秋水仙素在β-tubulin上Arg-390競

16、爭結合同一結合位點,直接影響微管聚合作用和微管依賴性進程。可以導致細胞周期永久性或短暫阻滯,以往研究證實噻氨酯噠唑可以明顯地增加抑制在第一次減數(shù)分裂的卵泡數(shù)。,初步驗證了大鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法用于雌性生殖毒物鑒定和機制研究的可行性。 小結： 1、基本建立了小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法。 2、建立了大鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法,國內外文獻尚未報道比較完整地觀察大鼠卵泡發(fā)育過程和卵子形成的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。 3、用大鼠

17、腔前卵泡培養(yǎng)方法觀察了四種化學物對卵泡發(fā)育、激素合成和卵子形成的影響,以及對不同發(fā)育階段卵泡的毒作用。進一步揭示了氯化鎘、DEHP、MEHP、噻氨酯噠唑四種卵巢毒物的雌性生殖毒作用特征,為闡明其毒作用機制提供了某些依據(jù)。 4、初步提出一個以卵泡形態(tài)學改變、卵泡分化階段、卵泡存活率、卵丘細胞粘液化、激素(E2、P)分泌量、卵母細胞直徑、極體形成率為評價指標的大鼠腔前卵泡體外毒性研究系統(tǒng)。該系統(tǒng)可有效鑒定卵巢毒物,并可用于毒物作用階