大鼠腔前卵泡體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及其在雌性生殖毒性研究中的應(yīng)用.pdf

1、目前雌性生殖毒性評(píng)價(jià)方法主要采用整體動(dòng)物試驗(yàn)，存在的主要問(wèn)題是所需動(dòng)物數(shù)多，不符合3R原則；實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、所需受試樣品量多，難以滿(mǎn)足化學(xué)品快速發(fā)展的需求；所提供的毒作用機(jī)制等信息有限，不足以提供安全性和危險(xiǎn)度評(píng)定的需求，也不符合現(xiàn)代毒理學(xué)發(fā)展的要求。為此，近幾年國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種體外雌性生殖毒性試驗(yàn)方法，包括卵巢器官和卵巢皮質(zhì)薄片培養(yǎng)方法和大鼠顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞體外毒性試驗(yàn)法。但這些體外方法無(wú)法對(duì)卵泡發(fā)育和卵子生成做出客觀評(píng)價(jià)，而這恰恰

2、是雌性生殖毒性研究的關(guān)鍵所在。因此，迫切需要發(fā)展既能快速檢測(cè)雌性生殖毒性又能更好地研究其作用機(jī)制的新方法。近年新發(fā)展的體外卵泡培養(yǎng)方法，能對(duì)卵巢的主要功能即卵泡發(fā)育、激素生成和卵子發(fā)生進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，可在卵泡不同發(fā)育階段對(duì)卵泡每一組分進(jìn)行分析，對(duì)卵泡發(fā)育，卵子發(fā)生和激素調(diào)控等生殖生物學(xué)機(jī)制和生殖毒作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，因而受到生殖生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和生殖毒理學(xué)等領(lǐng)域的關(guān)注。
　　 我室萬(wàn)旭英等率先建立了大鼠腔前卵泡體外二維培養(yǎng)模型，

3、但未來(lái)體外毒性測(cè)試方法的發(fā)展趨勢(shì)是發(fā)展基于三維培養(yǎng)模型的方法，目前國(guó)外已有小鼠腔前卵泡三維培養(yǎng)模型的報(bào)道，但大鼠僅有短期三維培養(yǎng)的報(bào)道，尚無(wú)大鼠腔前卵泡體外三維完整培養(yǎng)模型的研究報(bào)道。
　　 本研究擬在以往研究基礎(chǔ)上，建立一個(gè)能支持大鼠腔前卵泡生長(zhǎng)并產(chǎn)生成熟卵母細(xì)胞又適用于毒性研究的體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)；然后用雌性生殖毒物進(jìn)行驗(yàn)證研究。目的是為建立一個(gè)既可對(duì)雌性生殖毒物進(jìn)行篩選或鑒定，又可對(duì)生殖毒作用機(jī)制進(jìn)行研究的體外毒性試驗(yàn)系統(tǒng)提

4、供依據(jù)。
　　 一、大鼠腔前卵泡體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
　　 目的：建立一個(gè)支持大鼠腔前卵泡生長(zhǎng)并且能夠產(chǎn)生成熟卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。方法：從12-14天齡的雌性SD大鼠卵巢中機(jī)械性分離腔前卵泡(140-170μm)，然后在三維的海藻酸鈉和二維的微孔板中連續(xù)培養(yǎng)10天。三維培養(yǎng)效果通過(guò)卵泡發(fā)育的形態(tài)學(xué)、激素分泌，排卵率以及卵母細(xì)胞成熟率等進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與二維培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：在三維培養(yǎng)期間卵泡一直保持著三維的結(jié)構(gòu)，

5、而在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)兩天后卵泡膜細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，在接下來(lái)的培養(yǎng)過(guò)程中大部分卵泡的卵泡膜細(xì)胞向四周擴(kuò)散，顆粒細(xì)胞突破基底膜。三維培養(yǎng)系統(tǒng)中卵泡的存活率、有腔形成率、COCs排出率以及PB形成率均高于二維培養(yǎng)系統(tǒng)，分別為95.7vs.90.7％(P＜0.05)、72.1vs.33.6％(P＜0.05)、79.3vs.39.8％(P＜0.05)，57.1vs.31.9％(P＜0.05)。在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中，從腔前卵泡到卵母細(xì)胞成熟以及第一極

6、體的形成，形態(tài)學(xué)觀察顯示大鼠腔前卵泡體外發(fā)育特征和體內(nèi)相似。雌二醇和孕酮的分泌模式與卵泡的形態(tài)學(xué)變化以及分化情況相一致。結(jié)論：本研究建立的大鼠腔前卵泡體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)是成功的。
　　 二、雙酚-A對(duì)大鼠卵泡體外生長(zhǎng)發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的影響
　　 目的：觀察雙酚-A(BPA)對(duì)大鼠卵泡體外生長(zhǎng)發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟的影響，驗(yàn)證該系統(tǒng)用于生殖毒性研究的可行性。方法：從12-14天齡的雌性SD大鼠卵巢中機(jī)械性分離腔前卵泡(140-

7、170μm)，隨機(jī)分為3個(gè)處理組(50～150μM)及一個(gè)對(duì)照組，然后在三維的海藻酸鈉中連續(xù)培養(yǎng)10天。結(jié)果通過(guò)卵泡發(fā)育的形態(tài)學(xué)、激素分泌，排卵率以及卵母細(xì)胞成熟率等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：對(duì)照組卵泡在連續(xù)的10天培養(yǎng)過(guò)程當(dāng)中，絕大多數(shù)都經(jīng)歷了腔前卵泡、有腔卵泡以及成熟卵泡階段。與對(duì)照組相比，隨著劑量的增加卵泡存活率、有腔形成率，COCs排出率以及PB率均降低，100μM及以上劑量下與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。處理組中，卵

8、泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖受到不同程度的抑制，100μM及以上劑量下與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。雌二醇和孕酮的分泌量隨著劑量的增加而減少，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：本研究劑量下BPA抑制卵泡的生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞的成熟；初步驗(yàn)證說(shuō)明大鼠卵泡體外長(zhǎng)期三維培養(yǎng)模型適用于毒性研究。
　　 上述結(jié)果顯示，本研究建立的三維培養(yǎng)系統(tǒng)能夠支持大鼠腔前卵泡生長(zhǎng)并產(chǎn)生成熟卵母細(xì)胞，而且在卵泡存活率、有腔形成率、