軟骨藻酸分子毒理學(xué)機(jī)制及紫甘薯花青素神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、擬菱形藻是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的可引發(fā)有毒赤潮的唯一硅藻種屬,其產(chǎn)生的軟骨藻酸(domoicacid,DA)是一種記憶缺失性貝毒,并發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期存在于海洋生物鏈中,為了降低軟骨藻酸對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境的危害及對(duì)人類健康的影響,本論文成功建立了軟骨藻酸小鼠慢性染毒模型,研究其神經(jīng)毒性和作用機(jī)制,并進(jìn)一步采用紫甘薯花青素(purplesweetpotatocolor,PSPC)處理改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,研究其對(duì)軟骨藻酸慢性染毒小鼠腦部海馬區(qū)的保護(hù)機(jī)制,以期為軟骨

2、藻酸解毒藥的研制提供重要的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)主要分為以下幾部分:
　　一、海洋藻毒素軟骨藻酸對(duì)小鼠的行為毒理學(xué)研究及紫甘薯花青素的干預(yù)效果研究
　　避暗法實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)軟骨藻酸顯著降低小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,進(jìn)一步采用NeuN熒光免疫組化技術(shù)檢測(cè),結(jié)果顯示軟骨藻酸能顯著引起小鼠腦部尤其是海馬區(qū)神經(jīng)元丟失。Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白NR1,NR2A和PSD95的表達(dá)均顯著下降,這也是軟骨藻酸小鼠認(rèn)知

3、損傷發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)紫甘薯花青素能顯著提高軟骨藻酸染毒小鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白的表達(dá),抑制海馬區(qū)神經(jīng)元丟失,從而有效改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
　　二、軟骨藻酸致小鼠神經(jīng)毒作用的線粒體損傷機(jī)制研究及紫甘薯花青素的保護(hù)作用
　　線粒體活性研究發(fā)現(xiàn)軟骨藻酸能引起小鼠海馬神經(jīng)元線粒體氧化呼吸鏈功能下降,ATP消耗顯著增加,并且能顯著降低PGC-1α的表達(dá),從而抑制線粒體增殖通路,導(dǎo)致電子傳遞鏈復(fù)合物ComplexI-V的表達(dá)

4、水平顯著下降,最終誘導(dǎo)線粒體功能發(fā)生紊亂。本實(shí)驗(yàn)成功建立ERαsiRNA小鼠模型,發(fā)現(xiàn)紫甘薯花青素能通過上調(diào)ERα的表達(dá),激活軟骨藻酸小鼠線粒體增殖通路,提高ComplexI-V的表達(dá),從而有效維持線粒體的正常功能,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　三、軟骨藻酸致小鼠神經(jīng)毒作用的氧化應(yīng)激分子機(jī)制研究及紫甘薯花青素的保護(hù)作用
　　軟骨藻酸小鼠海馬組織ReactiveOxygenSpecies(ROS)和蛋白羰基化水平均顯著提高,引起組織

5、氧化應(yīng)激的發(fā)生。除了線粒體功能紊亂導(dǎo)致ROS的過量產(chǎn)生外,軟骨藻酸還能顯著上調(diào)NADPH氧化酶p47phox和gp91phox的表達(dá)加重神經(jīng)組織氧化應(yīng)激損傷。而紫甘薯花青素能顯著降低ROS和蛋白羰基化水平,此外還可以通過抑制p47phox和gp91phox的表達(dá)減輕軟骨藻酸小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激。
　　四、軟骨藻酸致小鼠神經(jīng)毒作用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷機(jī)制研究及紫甘薯花青素的保護(hù)作用
　　采用westernblot和免疫共沉淀方法

6、研究表明軟骨藻酸能顯著提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress)標(biāo)志分子Grp78的表達(dá),激活分別由PERK和IRE1所介導(dǎo)的信號(hào)通路,引起ERstress的發(fā)生。紫甘薯花青素能有效阻斷這兩條信號(hào)通路的激活,并在一定程度上激活ERα介導(dǎo)的信號(hào)通路,改善線粒體功能,減少ROS的產(chǎn)生,抑制ERstress的發(fā)生。
　　五、軟骨藻酸致小鼠神經(jīng)毒作用的細(xì)胞凋亡機(jī)制研究及紫甘薯花青素的保護(hù)作用
　　采用westernblot和TUNEL染色方

7、法研究發(fā)現(xiàn),軟骨藻酸能引起小鼠海馬組織凋亡的發(fā)生,進(jìn)一步采用ERstress抑制劑PBA研究ERstress在神經(jīng)元凋亡過程中的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn),軟骨藻酸激活了分別由caspase-12,CHOP和JNK介導(dǎo)的三條內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路,誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。紫甘薯花青素能有效抑制軟骨藻酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。而ERα的沉默能抑制紫甘薯花青素的抗凋亡作用,結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)出紫甘薯花青素能夠通過激活ERα介導(dǎo)的線粒體增殖通路抑制軟骨藻酸引起的ERstre