原花青素抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究.pdf

1、目的:動(dòng)脈粥樣硬化（artherosclerosis，AS）是心血管系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的疾病。AS主要累及大中動(dòng)脈，可致管壁變硬，管腔狹窄，并引起一系列繼發(fā)性病變。血管內(nèi)皮損傷和功能障礙與動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，它是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)，是多種心血管疾病產(chǎn)生和惡化的基礎(chǔ)。近年研究顯示，氧化應(yīng)激在血管病變，尤其是AS過(guò)程中扮演著重要角色。葡萄籽原花青素(grapeSeedproeyanidin，GPC)是從葡萄籽中提取出來(lái)的一類多酚化

2、合物，它具有極強(qiáng)的抗氧化等活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)過(guò)氧化氫損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）凋亡建立血管內(nèi)皮氧化損傷模型，加以原花青素的干預(yù)。檢測(cè)原花青素能否抑制過(guò)氧化氫引起的細(xì)胞氧化損傷、細(xì)胞凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。這可為開(kāi)發(fā)干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗AS新藥提供一條新思路，為臨床的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞分為6組，即空白對(duì)照組（Control）、氧化損傷組（H2O2）、氧化損傷加入維生素C對(duì)照組

3、(VitC+H2O2)、氧化損傷加入原花青素（5μmol/L、25μmol/L，50μmol/L）濃度組(Proanthocyanidins-L+H2O2、Proanthocyanidins-M+H2O2、Proanthocyanidins-H+H2O2)。將750μmol/LH2O2作用于加入維生素C及不同濃度原花青素預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)（半胱氨酸蛋白酶表達(dá)測(cè)定時(shí)間為14小時(shí)），以四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色試驗(yàn)

4、，AnnexinV/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，乳酸脫氫酶（LDH）活性，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量為檢測(cè)指標(biāo)，并用 Western blot法檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1.MTT的結(jié)果顯示:過(guò)氧化氫明顯地減弱了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性，而在加入低、中、高濃度的原花青素干預(yù)后均可明顯地增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性。
　　2. AnnexinV/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示:過(guò)氧化氫明

5、顯地增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率，原花青素可以有效抑制過(guò)氧化氫引起的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
　　3.乳酸脫氫酶（LDH）活性，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量檢測(cè)顯示：750μmol/L過(guò)氧化氫明顯增加LDH水平、MDA量，降低NO含量，與正常組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，而在加入5μmol/L、25μmol/L，50μmol/L濃度原花青素干預(yù)后，LDH水平、MDA量活性明顯降低，與損傷組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，

6、加入5μmol/L濃度原花青素干預(yù)后，NO含量升高與損傷組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（p>0.05）,而加入25μmol/L，50μmol/L濃度原花青素干預(yù)后，NO含量明顯升高，與損傷組相比有顯著差異（p<0.01）。
　　4. Western blot結(jié)果顯示:過(guò)氧化氫刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞18h后，其Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯升高，與正常組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。而在5μmol/L、25μmol/L，50μmol/L濃度的原

7、花青素干預(yù)過(guò)氧化氫處理組后其Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯降低，與H2O2組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　結(jié)論：本研究表明，原花青素通過(guò)減輕內(nèi)皮細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞膜的完整性，促進(jìn) NO釋放以減輕過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。H2O2通過(guò)調(diào)節(jié)激活線粒體凋亡通路上Caspase-3表達(dá)導(dǎo)致人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。而原花青素干預(yù)后可抑制Caspase-3表達(dá)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率下降，對(duì)血管內(nèi)皮具有保護(hù)