食品毒理學食品毒理學實訓

1、第四章 食品毒理學實訓,實訓一 實驗動物的飼養(yǎng)管理實訓二 實驗動物分組、標記和染毒技術(shù)實訓三 實驗動物解剖和生物樣本采集、制 備技術(shù) 實訓四 小鼠急性毒性試驗實訓五 小鼠骨髓細胞微核試驗實訓六 小鼠精子畸變試驗,實訓一 實驗動物的飼養(yǎng)管理,一、實訓目的實驗動物的飼養(yǎng)管理是保障食品毒理學動物實驗的基礎技術(shù)，通過本次實訓了解實驗動物房的環(huán)境要求及管理要點，掌握實驗動物飼養(yǎng)管理的操作方法和程序，掌

2、握實驗動物健康的觀察和評價方法。,二、儀器和材料小鼠、大鼠、兔、飼養(yǎng)盒、墊料、水瓶及輔助器材、開口器、體溫表等,三、操作方法 1.大、小鼠的日常飼養(yǎng)管理 (1) 進入屏障動物房的準備 (2) 進入動物房后的觀察 (3) 大、小鼠的喂料 (4) 大、小鼠的喂水 (5) 大、小鼠換飼養(yǎng)盒 (6) 清潔衛(wèi)生和消毒 (7) 記錄,2.兔的日常飼養(yǎng)管理 (1) 工作人員進入兔室前須著工

3、作服，穿膠鞋，戴口罩，戴手套、帽子。 (2) 進入兔室后先觀察兔只健康狀況，記錄異常兔只并交由獸醫(yī)師處置。 (3) 飲水 (4) 飼料 (5) 衛(wèi)生消毒 (6)記錄,3.實驗動物健康的觀察和評價（1）動物的外表與行為觀察（2）個體檢查（3）采食和飲水觀察,四、實訓結(jié)果1.計算動物一晝夜之內(nèi)的攝食量和飲水量。2.對動物進行觀察檢查后，認真填寫以下記錄表，作出相應評價。,健康觀察記錄表動物品系：,綜合評

4、價： 觀察人： 日期：,實訓二 實驗動物的分組、 標記和染毒技術(shù),一、實訓目的實驗動物科學的分組、標記和合理的染毒是取得良好試驗結(jié)果和結(jié)論的前提，也是每一項毒理學試驗首先要做的工作。通過本次試驗掌握實驗動物雌雄鑒別方法、科學分組、標記和常用基本染毒技術(shù)。,二、儀器和材料 1．實驗動物：成年健康小鼠、大鼠、豚鼠、家兔若干只。 2．染料：結(jié)晶紫、苦味酸、品紅。 3．毛筆

5、或棉簽。 4．動物稱或天平 5．灌胃針,三、操作方法和步驟(一)健康動物的選擇和性別鑒定1.健康動物選擇：2.性別鑒定： ①大、小鼠；②豚鼠；③家兔。,（二)稱重、分組與標記 1．稱重：根據(jù)不同試驗要求，選擇不同體重的動物。在同一組內(nèi)，同性別動物體重差異應小于平均體重的10％，組間同性別動物體重均值應小于5％。稱量大、小鼠體重時天平的感量要求在0.1 g以下。,隨機分組表,,3.編號及標記（1）染色法。染料有苦

6、味酸酒精飽和液(黃色)、甲基紫酒精飽和液(紫色)或美藍溶液(藍色)、0.5％中性紅或品紅溶液(紅色)等。具體方法：a.按右上肩、右肋、右后肢、頸部、背中、尾根、左前肢、左肋、左后肢順序分別為1-9號，不染色為10號［圖4-1(a)］；b.以頭部為1號，按順時針方向依次在右耳、右前肢、右后肢、頸部、背中、尾根、左耳、左前肢、左后肢染色，分別為2-10號［圖4-1(b)］ 。,圖4-1大鼠和小鼠染色標號法,（2）耳緣孔口法。大、小鼠常用此法

7、。在耳緣不同部位（圖4-2)用針穿孔和剪刀剪口，穿孔和剪口后，用墨黑酒精液涂抹，使其著色，不易脫失。常以右耳代表個位，左耳代表十位?？妆硎?號、2號、3號和10號、20號、30號，一道口為4號、5號、6號和40號、50號、60號，二道口為7號、8號、9號和70號、80號、90號。穿孔和剪口配合，也可編1-99號，不穿不剪為100號。,,圖4-2 耳緣孔口標號法,（3）烙印法。適用于兔以上的動物。耳部消毒后，用刺數(shù)鉗在動物耳上刺號，再以墨

8、黑酒精液著色。也可用鑄鐵號碼燒紅后烙在動物體表部位，留下標記。這種方法可較長時間保留記號，適用于大動物標記。（4）號牌法。適用于大動物。將金屬或塑料牌號固定在該動物的耳上或頸下，也可掛在飼養(yǎng)動物的籠上。,（三)抓取和固定方法 1.小鼠 捉拿方法有二種：一種辦法是用右手提起尾部，放在鼠籠蓋或其它粗糙面上，向后上方輕拉，此時小鼠前肢緊緊抓著粗糙表面，輕輕撫摸，使安靜，然后迅速用左手拇指和食指捏住小鼠雙耳和頸背部皮膚，并以小指和手

9、掌尺側(cè)夾持其尾部固定于手中(如圖4-3)；另一種抓法只用左手，先用食指和拇指抓住尾都，再用手掌尺側(cè)及小指夾住尾根，然后用拇指及食指捏住其頸部皮膚。后者適于快速捉拿給藥。,,圖4-3 小鼠抓取法 圖4-4 大鼠抓取法,2．大鼠 基本同小鼠，但大鼠牙齒很尖利，不要突然襲擊式去抓。捉拿時右手慢慢伸向抓鼠尾，盡可能向尾根部靠近，將大鼠放在粗糙面上；左手戴防護手套，抓起其頸背部盡可能多的皮膚并固定其頭部以防咬傷

10、(如圖4-4)。也可將大鼠固定在固定器。注意捉拿時勿用劇烈動作激怒之。3．豚鼠 以拇指和中指從豚鼠背部繞到腹下，另一只平托其臀部(如圖4-5)。體重小時可用一只手捉拿，體重大時宜用雙手。,4．家兔 用右手大把抓住頸背部皮膚，輕輕提起，左手立即托住家兔的臀部或腹部，使其重量移向左手(圖4-6)，這樣既不傷害家兔，也避免兔抓傷人。捉家兔切忌只抓兩耳。,圖4-5 豚鼠抓取法 圖4-6 家

11、兔抓取法,（四)染毒方法 1．大、小鼠灌胃法： 使用lmL注射器和灌胃針，用左手拇指和食指捏住大、小鼠兩耳及頭后皮膚，其余手指將大鼠或小鼠的背部皮膚和尾巴壓在手掌間，使其軀干垂直，腹部朝內(nèi)，頭部向上，略有一個傾斜度，固定好后，右手持注射器，將針頭由動物口角插入口腔，避開牙齒，再從舌面沿咽后壁順著吞咽動作徐徐滑入食道下端，遇有阻力時，可輕輕上下左右滑動，一旦感覺阻力消失，即可滑入胃內(nèi)(如圖4-5)。灌胃針插入深度，一般小鼠3～4

12、cm，大鼠、豚鼠4～6cm。,2.小鼠腹腔注射法：左手緊握動物，右手將注射針頭從左或右下腹部朝頭部方向插入，針頭與腹壁角度不宜太小，否則易人皮下。針頭插人不宜太深或太近上腹部，以免刺傷內(nèi)臟。(如圖4-6)3.小鼠皮下注射法：可由兩人合作，一人抓住小白鼠，另一人左手捏起背部皮膚，右手持注射器將針頭刺人背部皮下。若熟練，也可一人操作(如圖4-7)。,圖4-5 小鼠灌胃法 圖4-6小鼠腹腔注射法 圖

13、4-7小鼠皮下注射法,4.小鼠尾靜脈注射法：一人抓住小鼠，或?qū)⑿“资笾糜诠潭ㄆ鲀?nèi)，使鼠尾外露，用酒精棉球涂擦，或?qū)⑹笪步?0℃熱水中0. 5min，使血管擴張。用左手拉住尾尖，選擇一條擴張最明顯、距尾尖1/4處的尾靜脈，右手持帶有4號針頭的注射器刺人血管注射。如注射有阻力，且局部變白，應拔出針后，在第一次刺點的上方重新進行(如圖4-8)。5.小鼠腦室注射法：由兩人合作，一人固定好小鼠，另一人用眼科鑷提起兩耳連線中間處的皮膚，用手術(shù)剪

14、快速剪去距鑷尖0.3cm處的皮膚，暴露出顱骨。在距冠狀縫和矢狀縫各砰1.5mm左右處，先用小號鐘表改刀(固定刀頭深為2.0mm)在顱骨上穿一小孔，然后將4號或5號針頭垂直插入2-2.5mm，進行腦室注射(如圖4-9)。,,圖4-8 小鼠尾靜脈注射法 圖4-9 小鼠腦室注射法,實訓三 實驗動物解剖和生物樣 本采集、制備技術(shù),一、實訓目的實驗動物解剖和生物樣本采集、制備是毒理學

15、研究中極為重要的基本操作技術(shù)，通過本次實訓了解實驗動物的內(nèi)臟形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，掌握實驗動物的處死方法、解剖技術(shù)，能辨認內(nèi)部器官、正確分離組織器官；掌握血液采集方法、血清和血細胞分離技術(shù)，大鼠尿液收集方法、組織勻漿制備技術(shù)。,二、儀器和材料 (1)實驗動物 成年健康小鼠、大鼠、家兔。 (2)器材 鼠籠，大鼠代謝籠，大、小鼠固定板。手術(shù)剪，鑷子，兒科小骨鉗，塑料離心管(2～10 mL)，玻璃毛細管(內(nèi)徑l～1.5mm)，注射器(1m

16、L、2mL和5mL)，吸管，滴管，勻漿器。離心機，電子天平。 (3)試劑 抗凝劑(0.5％肝素生理鹽水溶液)；溶液(生理鹽水或某種緩沖液)。 (4)其他 碘酒，酒精棉球，干棉球，濾紙。,1.采血 (1) 鼠尾采血 (4) 腹主動脈或股動(靜)脈采血 (2) 眼眶靜脈叢采血 (5) 斷頭采血 (3) 摘眼球采血 (6) 心臟采血,實驗動物安全采血量,2．血清與血細胞分離

17、 (1) 血清的制備 將全血置37℃溫箱保溫lh，4℃冰箱中保存3～4h，以3000～4000r／min離心15min，取上清液低溫保存?zhèn)溆?。血清呈淡黃色，如呈淡紅色或紅色，表明有溶血，可能影響許多指標的測定，一般應廢棄。 (2) 血細胞分離 將血液采集在經(jīng)抗凝劑處理的容器中，混勻，2000r／min離心20min，小心吸出血漿。血漿與紅細胞之間有一薄層白細胞，需要時小心吸出置另一離心管中，不需要時可棄去。離心管中的沉

18、淀為紅細胞，加入等體積生理鹽水，輕輕混勻，使紅細胞懸浮，再次離心，棄上清液。如此重復3次，直至上清液無色透明為止，即獲得紅細胞。白細胞可依同法洗滌處理。,3．尿液收集 (1) 代謝籠法 適用于大、小鼠，尿液通過代謝籠的大小便分離漏斗與糞便分開。因大、小鼠尿量較少，操作中有損失和蒸發(fā)可造成較大的誤差，故一般要采集5h以上的尿液，取平均值。 (2) 反射排尿法 適用于小鼠，提起小鼠，可反射性排尿。,4．實驗動物的處死方法

19、 (1) 頸椎脫臼法： 多用于小鼠。 (2) 空氣栓塞法：多用于兔、犬、猴等大動物。 (3) 斷頭法：用于大、小鼠、琢鼠。 (4) 急性放血法：用于大鼠、小鼠。 (5) 擊打法：適用于較小的動物。 (6) 化學藥物致死法：適用于各種動物。 (8) 其他：電擊法、槍擊法、微波法等。,,5.實驗動物的大體解剖 在實驗動物處死后應立即解剖，越早越好。小鼠仰放在解剖盤上，用大頭針固定住四肢，提起生殖器前方的皮膚，用剪子剪一小口

20、，沿腹中線剪到頜下，把皮膚向兩邊分離。再剪開下腹部的肌肉，也沿中線剪開肌肉到胸骨下緣，向左側(cè)剪斷肋骨下端后，向前上方剪，直到斷開左邊鎖骨。剪時注意刀尖稍向上挑以免傷及內(nèi)臟。右側(cè)也同樣處理后就可以揭去胸部前壁，這樣就顯示出其內(nèi)部器官自然排列位置。將肝臟和胃向后推可見橫膈，隔開胸腔和腹腔，中央為結(jié)締組織的中央腱，其他部分為膈肌，為哺乳類所特有。觀察心臟跳動情況以及腸蠕動的情況；觀察有關(guān)臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質(zhì)地、切面。

21、 依次完整的取出①腹腔臟器；②胸腔臟器；③腎臟和腎上腺；④泌尿器官和生殖器官；⑤顱腔臟器并對指定的臟器稱重，并計算臟器系數(shù)。,6. 組織病理學檢查常用部位有心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、睪丸、腸等。對指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10％福爾馬林中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切片、HE染色)。應詳細記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。必要時，請其他的病理學家對有疑問的或有爭

22、論的發(fā)現(xiàn)進行復查。利用特殊染色、組織化學及電子顯微鏡技術(shù)研究毒作用機制。,7.組織勻漿的制備 (1) 動物處死 應根據(jù)試驗要求選擇合適的方法，如制備肺組織勻漿時不能用斷頭法處死，因易引起肺淤血(2) 臟器制備 動物處死后快速取出所需完整臟器，迅速置冰浴中，用冷生理鹽水洗去血污，必要時用冷生理鹽水灌流以除去血液。剝?nèi)ヅK器外膜，用濾紙吸干臟器表面水分，稱重、定位留取所需組織備用或置冰箱(或液氮)中凍結(jié)保存。(3) 勻漿制備 定量

23、稱取臟器、剪碎，置勻漿機中，按設計要求加入一定量比例的溶液(生理鹽水、緩沖液、有機溶劑等)，在一定轉(zhuǎn)速下研磨一定時間，有時需在冰浴中研磨，如制備肝勻漿S9上清液或分離細胞組分，全部操作均應在低溫(0～10℃)下進行,,四、實訓結(jié)果(1) 數(shù)據(jù)記錄，如下表所示，并計算臟體比（如肝／體比、腎／體比、脾／體比等)。(2) 器官顏色和形態(tài)描述。,實訓四 小鼠急性毒性試驗,一、實訓目的將外源化學物經(jīng)口染毒求出LD50是毒理學研究中重要的基本

24、技術(shù)和基礎工作之一。通過該試驗了解受試物的毒性大小、毒性特點及安全性，掌握改良寇氏法或霍恩氏法的試驗設計及LD50的計算方法，掌握化學毒物的急性毒性分級標準和評價方法。,二、實訓原理急性毒性試驗的原理是動物一次或24h內(nèi)多次接觸外源化學物后，觀察急性毒性反應及其程度，以及中毒死亡的原因及特征，了解受試動物毒性反應的劑量-反應關(guān)系，求出LD50。,三、儀器和材料1．體重l8～22g小鼠。 2．灌胃針、注射器5套。3．25mL容量瓶

25、、小燒杯各5個。4．10mL及l(fā)mL刻度吸管各5個。5．飼養(yǎng)籠。6．HgCl2粉末,四、操作方法及步驟(一)改良寇氏法(Karber) 1．本次實驗設5個劑量組(急性毒性試驗一般設5~7個劑量組)，試驗動物隨機分到五組。2．確定染毒劑量。經(jīng)預試驗知到HgCl2的0％～l00％的致死劑量范圍為8～210mg/kg。 由r=lg-1(lgb–lga)/(n-1)，計算得r=2.27式中，r為各組劑量組公比。各

26、組劑量按等比級數(shù)遞增，則各組正式劑量確定為：8，18.2，41.3，93.8，213mg／kg。,3．配制藥液 按20mL/kg體重等容積灌胃。先從高劑量組配制，再按公比稀釋配制各組藥液(CⅤ→CⅣ→CⅢ→CⅡ→CⅠ)。那么CⅤ=213mg/kg÷20mL/kg=10.65mg/mL藥液配制： a.配制25mLCⅤ即取HgCl2266.25mg定容至25mL。將CⅤ濃度依次釋稀2.27倍。 b.配制C

27、Ⅳ，把CⅤ稀釋2.27倍。配制25mLCⅣ需CⅤ液 M==11mL4.計算每只動物實際灌胃量。每只小鼠實際灌胃量=0.02ml/g×該鼠體重g,,5. 灌胃。灌胃前應禁食4小時，空腹灌入，灌胃后3～4h再喂食。灌胃方法如實訓二所述。若遇動物掙扎，應立即停止進針或?qū)⑨槹纬?，絕不可進針不順而硬向內(nèi)插，以免損傷或穿破食道或誤入氣管、肺，造成動物立即死亡。立即死亡的，要另補動物。 6．觀察記錄,表4-9 急性毒性反應觀察記

28、錄表,7.統(tǒng)計及計算（1）LD50=lg-1[Xm-i(∑P-0.5)] 式中 Xm：最大劑量組劑量對數(shù)值；i：相鄰兩組劑量高劑量與低劑量之比的對數(shù)(相鄰兩組對數(shù)劑量的差值)；P：各組動物死亡率，用小數(shù)表示(如果死亡率為80％應寫

29、成0.80)；∑P：各組動物死亡率之總和。（2）SlgLD50=i× 式中 SlgLD50：lgLD50的標準誤；p: 各組實驗動物死亡率；q:各組實驗動物存活率；n：實驗動物組數(shù)。（3）LD50的95％可信限=1g-1(lgLD50士1.96SlgLD50) LD50的平均可信限= LD50士(LD50的95％可信限的高限-低限)／2,,五、結(jié)果分析與毒性評價

30、1.急性毒性分級,對人可能致死的估計量,表4-10 外源化學物急性毒性分級（WHO）,2.急性毒性評價 外源化學物的經(jīng)口LD50 （1）大于10g/kg.bw，安全（2）大于人可能攝入量的10倍，有希望使用，應進入下一階段試驗（3）在人可能攝入量10倍左右，重復試驗（4）小于人可能攝入量的10倍，放棄不用3.確定受試物HgCl2的毒性大小和安全性,實訓五 小鼠骨髓細胞微核試驗,一、實訓目的學習小鼠骨髓嗜多染紅細

31、胞(PCE)微核測定方法，了解化學毒物對骨髓細胞染色體的損傷作用，掌握骨髓細胞微核測定的原理和操作方法。,二、實訓原理微核是在細胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進入子細胞形成細胞核時，仍然留在細胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無著絲粒斷片或環(huán)。它在末期以后，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在細胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成，由于比核小得多故稱微核。這種情況的出現(xiàn)往往是受到染色體斷裂劑作用的結(jié)果。另外，也可能在受到紡綞體毒物的作用時，主核沒有能夠形成，代

32、之以一組小核。此時小核往往比一般典型的微核稍大。,三、儀器和材料 (一)試劑 1.甲醇(分析純)。 2.冰醋酸(分析純)。 3.吉姆薩(Giemsa)儲備液：稱取Giemsa染料lg，逐漸加入少許甘油在研缽中研細溶解，共加入66mL，甘油混勻，于60℃溫箱中保溫90min，冷卻后再加入66mL甲醇混勻，于室溫中靜置1～2周，然后過濾，用棕色瓶貯存?zhèn)溆谩?.吉姆薩(Giemsa)應用液取Giemsa貯備液1份，加pH6.8的

33、磷酸緩沖液9份，混勻，臨用時配制。 5.小牛血清。 6.pH6.8磷酸鹽緩沖液：取甲液49.5ml,乙液50.5 ml混勻即可。 （1）甲液(即1/15mol/L Na2 HP04)：稱取無水Na2 HP04 9.47g溶于l000mL蒸餾水中(Na2 HP04 ,若含有2、7或l2分子結(jié)晶水時，分別稱取11.87g,17.87g或23.88g)。 （2）乙液(即1/15mol/L KH2P04)：稱取K

34、H2P04 ，9.48g溶于l000mL蒸餾水中。 7. 受試毒物：環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C,,(二)器材 手術(shù)剪，晾片架，電吹風機，2mL注射器及針頭，載玻片及推片，定時鐘，止血鉗，顯微鏡(具油鏡頭)，細胞計數(shù)器。,四、操作方法與步驟 1.動物選擇：常用的實驗動物為大、小鼠。以小鼠用得最多，要求體重18～20g，7～12周齡。每組l0只左右。2.染毒次數(shù)與取樣時間：采用多次染毒的方案。每天染毒一次，共4d，第5天取樣

35、。這樣，僅取樣一次就能覆蓋24～72h高峰，如果高峰延遲到96h也不會漏掉。故推薦以4次染毒后取樣為常規(guī)方案。3.劑量選擇：受試物的最大劑量除因溶解度所限外，應達最大耐受量，或以該化合物的80％LD50為最高劑量。在一般情況下，應設4～5或更多試驗組，劑量水平跨3個以上數(shù)量級。另設陽性和陰性對照組。4.陽性對照：可用環(huán)磷酰胺(50～100mg/kg)或絲裂霉素C(10mg/kg)。腹腔注射一次或二次均可。,（二）操作步驟 1

36、.染毒：按確定途徑給動物染毒，同時做陽性及陰性對照 2.涂片：用頸椎脫臼方法處死動物，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕。剖開胸腹部，取下胸骨，剔去肌肉。將胸骨骨髓擠于有一滴小牛血清的載玻片上，推片。 3.固定：將推好晾干的標本玻片放入染色缸中用甲醇溶液固定15min，取出晾干。 4.染色：用新鮮配制的l0％Giemsa染液(Giemsa原液l份加pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份)染色l0～15min。沖洗后晾干。

37、 5.觀察計數(shù)：先在低倍鏡下觀察，選擇分布均勻、染色較好的區(qū)域，再在油鏡下觀察計數(shù)。PCE細胞呈灰藍色，一個細胞內(nèi)可出現(xiàn)一個或多個微核；NCE呈橘黃色，無核。微核發(fā)生率（‰）=含微核的PEC數(shù)/觀察的PEC數(shù)×1000,實訓六 小鼠精子畸變試驗,一、實訓目的精子畸變試驗是檢測受試化學毒物能否破壞哺乳動物精子正常形態(tài)的試驗方法，通過本次實驗，了解正常精子和畸變精子的形態(tài)，掌握精子畸變試驗的原理和步驟。,,二、實訓原理

38、 引起精子畸變的原因很多，畸變的機理也無定論。其中一些理論認為化學物質(zhì)可能導致精子形成的有關(guān)基因發(fā)生突變，引起精子畸變率增高。精子的成熟和正常形態(tài)發(fā)生過程受多種基因控制，當這些基因中的任一個基因在化合物的作用下發(fā)生突變，就會導致精子的畸形率增高。某些特殊的染色體重排，如性-常染色體易位，是化合物誘發(fā)精子發(fā)生畸形率增高的主要機理。但是公認精子畸形率增高，并非必然意味著是受試物誘發(fā)突變的結(jié)果，某些其他因素，如缺血、變態(tài)反應、感染和體

39、溫增高等，亦可能導致精子畸形率增高。,,三、儀器和材料(一)器材手術(shù)剪刀、眼科直頭小鑷子、大鑷子、載玻片、染色缸、晾片板、擦鏡紙、干凈紗布、吸頭滴管、顯微鏡，離心機、離心管等(二)試劑生理鹽水、甲醇、1％伊紅染液。受試毒物：環(huán)磷酰胺或甲基磺酸乙酯。,四、操作方法與步驟(一)試驗設計1.動物選擇：一般采用6～8周齡的雄性小鼠。因其較為經(jīng)濟，而且已有許多實驗證實，在該實驗系統(tǒng)中小鼠最為敏感。每組應保證至少有5只存活動物。2.劑

40、量和分組：受試物至少設3個劑量組，并同時設陽性和陰性對照組。受試物高劑量組的總劑量應能使部分動物死亡，然后以l/5或1/10遞減作為中、低劑量組。 陽性對照可給予甲基磺酸乙酯60mg/kg或環(huán)磷酰胺20mg/Kg，腹腔注射，每天1次，連續(xù)5d。陰性對照使用等體積的溶劑。,(二) 操作步驟 1.染毒和處死：受試物多用腹腔注射。每天一次，連續(xù)5天給藥。一般在第一次給藥后第35天一次處死動物，取樣制片?；蛟诮o藥后每周處死一批動物，

41、連續(xù)進行動態(tài)觀察，直到精子形態(tài)恢復正常。 2.制片:（1）頸椎脫臼法或摘眼球取血處死小鼠，取出兩側(cè)附辜放入盛有1ml生理鹽水的小燒杯中。（2）用眼科剪刀把附睪剪成4小塊，靜止5-10min，讓精子充分游離出來。（3）用吸管尖端吸取精子懸液 ，注意吸取時盡量避開組織碎塊。（4）將吸取的精子懸液摘一滴于干凈的載玻片上，用吸管輕輕推片。（5）空氣干操，甲醇固定10-15分鐘，再用1％伊紅染液染色20分鐘，小心用自來水沖洗干凈，空氣干澡

42、 3.鏡檢：制好的精子涂片先在低倍鏡下找到背靜清晰，精子重疊較少的區(qū)域，然后用高倍鏡按一定順序檢查1000個完整的精子，記錄其中畸形精子數(shù)及畸形精子類型。,五、結(jié)果分析與評價 不同品系小鼠的精子畸形率本底值有較大差異，其影響因素也較多，故實驗結(jié)果的判斷應與相同實驗條件下同時進行的陰性對照組比較，且陰性對照組的精子畸形率應與本實驗室過去的記錄接近。而陽性對照組精子畸形率必須顯著高于陰性對照組(P<0.01)，否則所得結(jié)果不可靠，