誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化及其機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病是由于分泌胰島素的β細(xì)胞缺失或功能異常而引起的糖代謝異常疾病。目前,盡管多種藥物尤其是胰島素的應(yīng)用對糖尿病的治療效果有了很大改善,但還沒有一種治療手段可以完全治愈糖尿病,阻止其并發(fā)癥的發(fā)生。除了Ⅰ型糖尿病的中β細(xì)胞總數(shù)的缺乏外,新近研究發(fā)現(xiàn)在Ⅱ型糖尿病患者胰腺中同樣存在β細(xì)胞團(tuán)減少的現(xiàn)象,因此通過胰腺或胰島移植是根治糖尿病的唯一手段,但是供體胰島的嚴(yán)重缺乏限制了其廣泛開展。干細(xì)胞因其多向分化潛能和自我更新的特性,已被越來越廣泛地應(yīng)

2、用于細(xì)胞替代治療的研究中。然而,將干細(xì)胞真正用于糖尿病的臨床治療還面臨許多問題。
　　細(xì)胞數(shù)量和功能不足是干細(xì)胞治療糖尿病所面臨的主要挑戰(zhàn)。盡管近年來,已經(jīng)建立了使用生長因子和小分子化合物,將多能干細(xì)胞分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法,但是多能干細(xì)胞分化成為內(nèi)分泌細(xì)胞需經(jīng)過定型內(nèi)胚層,胰腺祖細(xì)胞,內(nèi)分泌祖細(xì)胞以及特定類型內(nèi)分泌細(xì)胞五個階段,誘導(dǎo)時間長,不可控制的因素多,所以,目前還沒有一種方法可以獲得足夠數(shù)量、終末分化的功能性胰島細(xì)胞。

3、研究認(rèn)為,胰島的結(jié)構(gòu)和胰島細(xì)胞間的相互作用決定胰島細(xì)胞的功能,三維(threedimentional,3D)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可通過恢復(fù)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互關(guān)系彌補(bǔ)2D培養(yǎng)技術(shù)的不足,本課題擬利用3D培養(yǎng)技術(shù)從組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間相互作用的角度進(jìn)行研究,嘗試解決替代細(xì)胞分化效率和功能成熟的問題。
　　3D培養(yǎng)技術(shù)因其在體外構(gòu)建與體內(nèi)相近的細(xì)胞發(fā)育結(jié)構(gòu)系統(tǒng),成為研究細(xì)胞-細(xì)胞,細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用最直觀的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型,大量研究已證明,3D環(huán)

4、境下的誘導(dǎo)分化效率高于2D環(huán)境,并且3D細(xì)胞培養(yǎng)可以恢復(fù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)并提高細(xì)胞的功能。但是3D培養(yǎng)是否可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向胰島細(xì)胞的分化,3D結(jié)構(gòu)的細(xì)胞生長模式與胰島細(xì)胞功能成熟之間的關(guān)系還不清楚?；谝陨峡紤],本課題分為兩部分,第一部分的工作旨在探索3D細(xì)胞培養(yǎng)與胰島細(xì)胞功能之間的關(guān)系;第二部分在第一部分工作的基礎(chǔ)上,利用3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),模仿體內(nèi)胰島生長微環(huán)境,探討3D細(xì)胞培養(yǎng)對人胚胎干細(xì)胞(humanembryonicstemcel

5、ls,hESC)向胰島細(xì)胞分化過程中的影響,并初步分析其作用機(jī)制,為體外獲得有功能的種子細(xì)胞提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。
　　一、三維細(xì)胞培養(yǎng)對胰島細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制研究:通過懸浮培養(yǎng)小鼠β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞,形成類組織樣結(jié)構(gòu)的MIN6細(xì)胞團(tuán)(3D-MIN6),葡萄糖刺激胰島素釋放(GSIS)實(shí)驗(yàn)證實(shí),3D-MIN6較2D-MIN6在葡萄糖刺激下可以釋放更多的胰島素,q-PCR顯示3D-MIN6中胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),提

6、示3D細(xì)胞培養(yǎng)可以增強(qiáng)β細(xì)胞的基因表達(dá)和GSIS功能。RhoA和ROCK功能阻斷實(shí)驗(yàn)表明,3D-MIN6細(xì)胞通過抑制RhoA/ROCK通路,使F-actin重構(gòu),易化胰島素釋的釋放過程,另外,3D細(xì)胞培養(yǎng)和RhoA/ROCK功能阻斷可使細(xì)胞縫隙連接蛋白36(Connexin36,Cx36)的表達(dá)增高,而通過siRNA技術(shù)阻斷Cx36功能后,MIN6細(xì)胞的GSIS明顯降低,即使抑制RhoA/ROCK活性也不能恢復(fù)MIN6的胰島素釋放功能,

7、提示Rho/ROCK信號通路通過Cx36發(fā)揮調(diào)節(jié)胰島素釋放的作用。第一部分的研究表明3D細(xì)胞培養(yǎng)通過抑制RhoA/ROCK的活性,可以促進(jìn)Cx36的表達(dá),進(jìn)而加強(qiáng)MIN6細(xì)胞的GSIS功能。
　　二、誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化及其機(jī)制研究:本研究首先利用細(xì)胞因子和小分子化合物組合建立了誘導(dǎo)hESC向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞(pancreaseendocrinecell,PEC)的分化體系,通過27天的誘導(dǎo),hESC來源的PEC可以

8、合成內(nèi)分泌激素胰島素、胰高血糖素和生長抑素,并且能在Fosklin、KCL的刺激下分泌胰島素,但是對與葡萄糖的刺激反應(yīng)微弱。在此基礎(chǔ)上,我們分別對誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行了簡單的懸浮3D培養(yǎng)和基質(zhì)材料Matrigel包埋的3D細(xì)胞培養(yǎng),與常規(guī)2D培養(yǎng)相比,3D培養(yǎng)加強(qiáng)了hESC來源的PEC的內(nèi)分泌特異性,使胰島素陽性細(xì)胞的分化效率提高到23.7％,細(xì)胞內(nèi)胰島素的含量明顯增多,并且具備了GSIS的能力。通過對影響細(xì)胞間相互作用的粘著斑激酶(focal

9、adhesionkinase,FAK)研究發(fā)現(xiàn),3D組誘導(dǎo)細(xì)胞中FAK活性明顯低于2D組,抑制FAK或其下游ROCK的表達(dá),可以促進(jìn)內(nèi)分泌細(xì)胞定向分化的相關(guān)基因NGN3、NKX6.1、ISL1的上調(diào)表達(dá),說明FAK和ROCK通路參與了3D培養(yǎng)促進(jìn)內(nèi)分泌細(xì)胞定向分化的過程。另外TGFβ信號通路已被證實(shí)具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌細(xì)胞定向分化的作用,我們Westernblot結(jié)果顯示,下調(diào)FAK活性亦可抑制TGFβ下游Smad2的活性。在3D組誘導(dǎo)細(xì)胞中

10、還發(fā)現(xiàn)Cx36表達(dá)明顯上調(diào),抑制FAK和ROCK通路同樣可以提高Cx36基因合成和蛋白表達(dá),說明3D培養(yǎng)通過FAK、ROCK信號通路調(diào)控Cx36的合成與表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞GSIS的功能。小鼠體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)移植入體內(nèi)的PEC可以合成胰島素并根據(jù)體內(nèi)血糖水平調(diào)節(jié)其釋放。
　　綜上所述,本課題的研究表明,3D細(xì)胞培養(yǎng)條件有利于小鼠β細(xì)胞系MIN6胰腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)和GSIS功能的發(fā)揮。在hESC向PEC的分化過程中,3D細(xì)胞培養(yǎng)通過抑