單層貼壁法誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化及其機(jī)制初探.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)是從囊胚中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner mass cells，ICM)或原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells，PGCs)分離和克隆的多能性細(xì)胞，具有強(qiáng)大的自我更新能力和多向分化潛能，能夠在體內(nèi)或體外分化為成體中任何細(xì)胞類型。ES細(xì)胞作為體外理想的細(xì)胞模型，可以研究真核細(xì)胞在早期胚胎發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)和調(diào)控；也為未來的細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)帶來了希望。 平滑肌

2、細(xì)胞作為構(gòu)成血管壁的組織單元及維持血管張力的主要細(xì)胞成份，其分化和增殖在血管發(fā)生以及動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥和高血壓等疾病中起著重要作用。培養(yǎng)的平滑肌很難穩(wěn)定維持在一種表型，這在很大程度上限制了人們對其調(diào)控機(jī)理和途徑的研究，利用可誘導(dǎo)的SMC體外分化系統(tǒng)對于進(jìn)行SMC分子機(jī)制研究具有重要的價(jià)值。迄今為止，還沒有體外定向誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為平滑肌的報(bào)道。此外人胚胎干細(xì)胞分化為其他細(xì)胞譜系也由于分化效率和均一性等問題也限制了其在醫(yī)學(xué)治療上的應(yīng)用

3、。 本文我們首次將人胚胎干細(xì)胞(hESC)定向分化成平滑肌細(xì)胞(SMC)。通過單層貼壁途徑，利用高濃度的維甲酸(10μM RA)誘導(dǎo)10天后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測SM α-actin陽性細(xì)胞高達(dá)93％，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、RT-PCR、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、western blot、對促收縮劑刺激的響應(yīng)、出現(xiàn)自發(fā)收縮等指標(biāo)檢測，顯示誘導(dǎo)的細(xì)胞具有平滑肌細(xì)胞的典型特征。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不通過擬胚體途徑、沒有基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)、不經(jīng)過細(xì)胞分選過程，其誘

4、導(dǎo)程序簡單，誘導(dǎo)效率高。這種單因子，單層、高效率的體外誘導(dǎo)系統(tǒng)為研究平滑肌細(xì)胞發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理提供了一個(gè)極佳的平臺(tái)，此外高純度的誘導(dǎo)為將來細(xì)胞治療相關(guān)疾病提供了良好的細(xì)胞資源。 為了進(jìn)一步探索RA在高效誘導(dǎo)hES分化為SMC的作用機(jī)制，我們從RA代謝系統(tǒng)的關(guān)鍵酶CYP26s入手，分析了誘導(dǎo)過程中CYP26s，RARs和RXRs等基因的表達(dá)變化，并研究維甲酸代謝抑制劑、RA加入的時(shí)間及其持續(xù)處理時(shí)間對SMC分化效率的影響。我們揭

5、示了高濃度RA在hES細(xì)胞單層貼壁高效分化為SMC中的誘導(dǎo)和促凋亡的雙重效應(yīng)。在RA的作用下，由于RA的多生物學(xué)效應(yīng)，ES細(xì)胞啟動(dòng)了向多種細(xì)胞譜系的分化(包括SMC譜系)，然而分化早期誘導(dǎo)出的各種祖細(xì)胞由于CYP26s的表達(dá)不同，失活RA的能力出現(xiàn)了明顯差異，這些差異促使部分細(xì)胞(SMC前體細(xì)胞)由于CYP26s的高表達(dá)從而能夠逃脫凋亡命運(yùn)，最終使得ES細(xì)胞高效分化成為SMC。 目前ES分化策略大部分是采用擬胚體的方法，擬胚體能

6、夠模擬胚胎發(fā)育早期的各種事件，但也存在諸如分析分選困難、細(xì)胞間有著復(fù)雜的相互作用等弊端。為使得分化為特定細(xì)胞的效率更高，并能方便研究驅(qū)動(dòng)體外定向分化早期事情的分子機(jī)制，我們發(fā)展并完善了單層貼壁方法。單層貼壁進(jìn)行分化研究的前提就是要獲得高活力、高純度的ES細(xì)胞，因此本實(shí)驗(yàn)利用胚胎干細(xì)胞與飼養(yǎng)層細(xì)胞貼壁速度的差異，建立了一種簡單快速的分離MEF和ES細(xì)胞的差速貼壁方法。結(jié)果表明，在0.5％明膠包被的培養(yǎng)器皿中，差速貼壁1.5小時(shí)是分離ES細(xì)

7、胞與MEF的最佳時(shí)間，此時(shí)流式細(xì)胞統(tǒng)計(jì)MEF僅占細(xì)胞群體2.4％。通過對差速貼壁前后的ES細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶、單克隆形成率、ES細(xì)胞特異性標(biāo)志、三胚層分化潛能等指標(biāo)比較，證明純化后的ES細(xì)胞仍保持高活力、未分化狀態(tài)，這為后續(xù)進(jìn)行ES細(xì)胞單層貼壁分化提供了條件。此方法不僅對ES細(xì)胞的干性無明顯影響，可進(jìn)行后續(xù)的分化實(shí)驗(yàn)，而且與其他去除飼養(yǎng)層的方法相比還具有高效、經(jīng)濟(jì)、快速、簡單等優(yōu)點(diǎn)。為通過單層貼壁途徑進(jìn)行ES細(xì)胞定向分化研究解決了細(xì)胞材

8、料問題。 在建立了單層貼壁分化ES細(xì)胞系統(tǒng)基礎(chǔ)上，我們嘗試將組蛋白脫乙酰酶抑制劑(丁酸鈉)應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞分化的研究，使得ES細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的周期更短，效率更高，操作更簡便。利用組蛋白脫乙酰酶抑制劑-NaB打破組蛋白乙?；钠胶猓偈谷旧|(zhì)松散，從而抑制胚胎干細(xì)胞增殖，使起盡快步入分化狀態(tài)，隨即采用單層貼壁培養(yǎng)分化的方法結(jié)合添加神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液N2827使其分化成神經(jīng)細(xì)胞。結(jié)果表明此方法可獲得高比例的神經(jīng)細(xì)胞，在分化第4～6