氟化物誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞凋亡的相關(guān)研究.pdf

1、氟化物在口腔醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用，在牙本質(zhì)過敏、防齲、礦化機制和氟斑牙預(yù)防研究中扮演重要角色，在生活和臨床中被大量使用。已有研究發(fā)現(xiàn)高氟暴露的牙本質(zhì)礦化受到影響，高氟作用下多種細胞的礦化相關(guān)因子表達發(fā)生變化。牙髓的損傷刺激往往導(dǎo)致局部成牙本質(zhì)細胞凋亡或壞死，喪失其形成牙本質(zhì)的功能，同時也觀察到受損區(qū)牙本質(zhì)管樣結(jié)構(gòu)的修復(fù)性牙本質(zhì)的形成，這說明了成牙本質(zhì)細胞的凋亡是牙髓損傷修復(fù)中的重要現(xiàn)象，在牙髓損傷和修復(fù)的中間環(huán)節(jié)扮演重要角色。
　

2、　又有研究認為氟作用下的細胞膜氯離子通道受到影響,硫的轉(zhuǎn)運增加，有可能與礦化相關(guān)蛋白的表達,調(diào)控,修飾相互作用。進而推測其影響細胞礦化模式，促進硬組織的損傷修復(fù)過程。
　　由于成牙本質(zhì)細胞在牙本質(zhì)發(fā)育和改建扮演重要角色，能夠在人一生之中不斷地分泌成牙本質(zhì)基質(zhì)，生成修復(fù)牙本質(zhì)。所以研究氟化物誘導(dǎo)下成牙本質(zhì)細胞凋亡的適宜濃度和時間、牙本質(zhì)細胞發(fā)生凋亡的分子信號通路對于探索氟化物治療牙本質(zhì)過敏機制、探尋氟化物調(diào)控的硬組織礦化機制有重要的

3、意義。
　　本研究從確定氟誘導(dǎo)的濃度，觀察凋亡的發(fā)生，以及細胞凋亡的信號通路等不同層次，展開四個實驗：
　　實驗一：氟對成牙本質(zhì)細胞的增殖抑制。
　　本實驗觀察了成牙本質(zhì)細胞系(odontoblast-lineagecell,OLC)的生物學(xué)行為和氟刺激下的細胞形態(tài)變化。以不含血清的DMEM培養(yǎng)基孵育12h后，分別換以含NaF0-6mmol/L濃度的無血清DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12-48h后觀察細胞形態(tài)變化。繼而采用M

4、TT法和臺盼蘭排斥實驗檢測氟對OLC細胞的增殖抑制。結(jié)果：細胞在氟的作用下增殖分裂緩慢，4mmol濃度作用24小時抑制率可以達到50％以上。推測4mmol濃度作用12-24小時后可能誘導(dǎo)OLC細胞的凋亡出現(xiàn)。
　　實驗二：氟誘導(dǎo)的成牙本質(zhì)細胞系細胞的凋亡
　　為了進一步觀察氟誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞的凋亡，我們采用流式細胞術(shù)、原位末端標記法發(fā)現(xiàn)氟化鈉能夠誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞發(fā)生凋亡,采用透射電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)細胞凋亡后的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在4

5、mmol/L濃度下，westernblot試驗中發(fā)現(xiàn)了凋亡發(fā)生晚期重要的caspase-3蛋白發(fā)生了剪切,表明此濃度的氟誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞凋亡進入不可逆轉(zhuǎn)的狀態(tài)。
　　實驗三：氟化物通過MAPK途徑誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞凋亡。
　　為了進一步觀察MAPK通路對于成牙本質(zhì)細胞凋亡的意義，本實驗采用westernblot技術(shù)對JNK、ERK和p38及其磷酸化蛋白進行了檢測，發(fā)現(xiàn)JNK蛋白隨著濃度增加和作用時間延長，磷酸化程度不斷增強。E

6、RK的磷酸化過程在時間上表現(xiàn)為短期內(nèi)升高，降低后又升高的過程.但是隨著濃度增加而升高。p38未檢測到磷酸化改變。JNK抑制劑SP600125可以有效抑制JNK的磷酸化改變，ERK的抑制劑PD98059可以抑制部分磷酸化過程。這表明JNK信號通路參與了氟誘導(dǎo)的成牙本質(zhì)細胞凋亡，而ERK信號通路部分參與了此凋亡過程，p38則未參與氟化物誘導(dǎo)的成牙本質(zhì)細胞凋亡。
　　實驗四：線粒體途徑對氟化物誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞凋亡的影響。
　　為了

7、進一步觀察凋亡的另一經(jīng)典通路，線粒體信號通路對成牙本質(zhì)細胞凋亡的影響，我們又采用免疫組化法，使用MitoTrackerdeepred633線粒體熒光探針標記線粒體，觀察Bax在線粒體內(nèi)的定位情況，結(jié)合westernblot檢測凋亡的線粒體途徑中重要的兩個分子Bax和Bcl-2的表達情況，發(fā)現(xiàn)Bax轉(zhuǎn)位至線粒體并定位于線粒體外膜上，而Bax表達隨時間延長而增加，顯示凋亡不斷進展，Bcl-2作為抗凋亡蛋白，在氟誘導(dǎo)過程中增高以對抗凋亡的發(fā)生