Smads信號(hào)分子在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化中作用的研究.pdf

1、該課題研究的目的是觀察Smads信號(hào)分子在TGF-β1調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成中的作用,探討TGF-β1在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成中的作用機(jī)制.該研究包含三個(gè)部分:第一部分:Smads在MDPC-23細(xì)胞中的表達(dá)、調(diào)控及其在TGF-β1信號(hào)途徑中作用的研究;在這個(gè)部分,首先對(duì)從Dr.Jacques E.Nor獲得的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞系MDPC-23的生物學(xué)特征進(jìn)行了研究.結(jié)果表明MDPC-23保持了其原有的特性,

2、主要包括1)上皮樣細(xì)胞形態(tài),有多個(gè)細(xì)胞膜突起;2)易形成細(xì)胞結(jié)節(jié),細(xì)胞倍增時(shí)間少于24h;3)表達(dá)I型膠原、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)、骨橋素(OPN)和牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP).其次,對(duì)Smads分子在MDPC-23細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、調(diào)控及其功能進(jìn)行了研究.第二部分Smads在TGF-β1調(diào)控MDPC-23細(xì)胞分化中作用的研究;在這個(gè)部分,為了觀察Smads分子在MDPC-23細(xì)胞中的作用.用LipofectAMINE法分別將

3、Smad2、Smad3及它們的突變體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至MDPC-23細(xì)胞內(nèi),用300μg/ml G418篩選2周后得到陽(yáng)性克隆.陽(yáng)性克隆用anti-Flag單克隆抗體通過(guò)Western免疫印跡雜交進(jìn)一步鑒定.接著,研究了Smads是否參與TGF-β1對(duì)牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的調(diào)控.第三部分Smads在TGF-β1調(diào)控DSPP基因轉(zhuǎn)錄中的作用;為了了解Smads在TGF-β1調(diào)控DSPP基因轉(zhuǎn)錄中的作用.我們首先用PCR方法從小鼠MDPC-23細(xì)胞

4、基因組中克隆出部分DSPP啟動(dòng)子.擴(kuò)增出的大小為1.5kbp的片段首先用T4連接酶克隆到pGEM-T Easy載體中,正確克隆到pGEM-T Easy載體的片段用DNA測(cè)序鑒定.pGL3LUC-1243-+54bp和pGL3LUC-791-+54bp質(zhì)粒被用來(lái)觀察成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1對(duì)DSPP表達(dá)的潛在調(diào)控.進(jìn)一步觀察轉(zhuǎn)錄因子c-Jun或c-Fos是否和Smad3協(xié)同調(diào)控TGF-β1對(duì)DSPP啟動(dòng)子活性的轉(zhuǎn)錄抑制作用.C-Jun或