新型機(jī)械敏感離子通道Piezo在成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)和功能研究.pdf

1、Piezo機(jī)械敏感離子通道是2010年由Coste[1]等發(fā)現(xiàn)的一類機(jī)械敏感離子通道。該詞來源于希臘語(p?′esi)表示壓力的意義,表明其可以被壓力激活的特性。該通道家族包含有Piezo1和Piezo2兩個結(jié)構(gòu)和基因類似的蛋白,他們在包括膀胱、結(jié)腸和肺等多種組織中有表達(dá),Piezo2在背根神經(jīng)節(jié)表達(dá)豐富。這些蛋白預(yù)計包含24-36個的穿膜片段,既往的電壓門控鈉離子和鈣離子通道結(jié)構(gòu)包含六個四折疊的穿膜片段,Piezos顯然代表了一類新型

2、的膜蛋白家族。該研究小組運(yùn)用RNA干擾技術(shù)敲除培養(yǎng)的小鼠背根神經(jīng)細(xì)胞的Piezo2可以抑制壓力引發(fā)的快適應(yīng)機(jī)械敏感電流。故而認(rèn)為該通道家族在壓力的機(jī)械感受方面具有重要意義。
　　成牙本質(zhì)細(xì)胞是來源于神經(jīng)嵴的終末分化細(xì)胞,其位于牙髓感受最前沿的細(xì)胞,雖然他們與牙髓神經(jīng)纖維并無直接的突觸連接[2],但是由于成牙本質(zhì)細(xì)胞突起向牙本質(zhì)小管內(nèi)延伸,而眾多的離子通道在成牙本質(zhì)細(xì)胞有表達(dá),故而推測成牙本質(zhì)細(xì)胞是一個具有機(jī)械敏感性的細(xì)胞[3]。P

3、iezos是否在成牙本質(zhì)細(xì)胞上有表達(dá)尚未可知,他在成牙本質(zhì)細(xì)胞感受牙本質(zhì)小管液的流體運(yùn)動中扮演何種角色是個值得探討的問題。
　　本研究在成牙本質(zhì)細(xì)胞其他機(jī)械敏感離子通道研究的基礎(chǔ)上,采用免疫組化、免疫熒光雙標(biāo)、熒光金逆追蹤技術(shù)觀察Piezo機(jī)械敏感離子通道家族在成牙本質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)和定位,及其與神經(jīng)纖維和纖毛的關(guān)系;通過觀察胚胎和干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中通道蛋白的表達(dá)情況,推測其在干細(xì)胞分化中的作用。采用鈣離子測量系統(tǒng)觀察離子通道在成牙

4、本質(zhì)細(xì)胞感受機(jī)械刺激時的生理學(xué)作用。本研究首次圍繞Piezo這一新的機(jī)械敏感離子通道可能在成牙本質(zhì)細(xì)胞感受、傳導(dǎo)機(jī)械刺激中的作用這一核心問題,深入探討牙髓痛覺感受、傳導(dǎo)機(jī)制和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化作用,為揭示牙本質(zhì)過敏的關(guān)鍵致病機(jī)理奠定理論基礎(chǔ),有可能為牙本質(zhì)過敏的治療開拓新思路。研究分為以下三部分內(nèi)容:
　　一、Piezo蛋白的表達(dá)定位和追蹤研究
　　本實驗旨在通過PCR、實時定量PCR和免疫熒光標(biāo)記觀察到Piezo蛋白在成牙本

5、質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),同時比較了不同細(xì)胞、組織該通道蛋白的表達(dá)量,證實在三叉神經(jīng)節(jié)和成牙本質(zhì)細(xì)胞中均有較高表達(dá),在牙周膜組織也有少量表達(dá)。免疫熒光的標(biāo)記證實其主要表達(dá)在成牙本質(zhì)細(xì)胞靠近牙本質(zhì)側(cè),而且可見到由于其主要表達(dá)與成牙本質(zhì)細(xì)胞突起而環(huán)繞形成的黑色圓孔,應(yīng)為成牙本質(zhì)小管的輪廓。
　　Piezo通道蛋白表達(dá)于成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞和纖維,通過與NF160分子的共染,可以見到其表達(dá)區(qū)域大致相當(dāng),甚至可見Piezo在成牙本質(zhì)細(xì)胞突起

6、前沿表達(dá),推測其可能比神經(jīng)纖維更為靠前的感受牙本質(zhì)小管內(nèi)的液體流刺激。通過磨切大鼠表面牙釉質(zhì)開放牙本質(zhì)小管,涂抹熒光金進(jìn)行逆行追蹤?？梢园l(fā)現(xiàn)經(jīng)過一周,熒光金成功被運(yùn)輸?shù)饺嫔窠?jīng)節(jié)內(nèi)而與Piezo共染。
　　由此推斷:成牙本質(zhì)細(xì)胞突起可能是整個牙髓感受外界刺激的最前沿,而且,由于Piezo與神經(jīng)標(biāo)志物NF160共同表達(dá)與成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙髓神經(jīng)纖維和三叉神經(jīng)細(xì)胞,而開放牙本質(zhì)小管口的熒光金被成果逆行運(yùn)輸?shù)饺嫔窠?jīng)節(jié)內(nèi),故而推測成牙本質(zhì)

7、細(xì)胞是一個具有某些神經(jīng)細(xì)胞特性的感受器細(xì)胞,而Piezo作為一個已經(jīng)證明了的機(jī)械敏感離子通道可能在其中扮演了感受器的角色。
　　二、Piezo通道蛋白的體內(nèi)外功能研究
　　通過對體內(nèi)外成牙本質(zhì)細(xì)胞受到刺激時的通道進(jìn)行觀察,進(jìn)一步了解該通道蛋白的功能。實驗包括使用Bioflux模擬小管液流動造成的流體剪切力觀察OLC細(xì)胞受力后的電生理學(xué)行為的體外實驗和在大鼠牙本質(zhì)暴露模型對牙本質(zhì)施加影響,采取不同時間點的大鼠牙髓標(biāo)本,對其RN

8、A轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行觀察,以判斷長時間牙本質(zhì)暴露帶來的成牙本質(zhì)細(xì)胞長時間受力的可能影響。
　　研究發(fā)現(xiàn):OLC細(xì)胞在0.5dyne/cm2的流體剪切力作用下,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度出現(xiàn)顯著升高,給予GsMTx4[4]這種特異性的Piezo通道阻滯劑后,鈣離子濃度逐步降低。推測:成牙本質(zhì)細(xì)胞是壓力敏感型細(xì)胞,0.5dyne/cm2的剪切力可以激活其壓力敏感電流,而Piezo通道特異阻滯劑可以有效的減低鈣離子濃度,懷疑Piezo通道在成牙本質(zhì)細(xì)胞

9、壓力激活的過程中有重要作用。
　　在大鼠牙本質(zhì)暴露模型,Piezo通道蛋白的表達(dá)表現(xiàn)出緩慢增加的趨勢,而且檸檬酸飲水組與單純的牙本質(zhì)暴露組差異不明顯。推測長期的外界刺激可能造成離子通道的表達(dá)增加,這可能是適應(yīng)性的表達(dá)變化。
　　三、Piezo通道蛋白在干細(xì)胞分化過程中的功能研究
　　通過PCR法,我們觀察到牙髓干細(xì)胞并不表達(dá)Piezo通道蛋白,為了進(jìn)一步了解Piezo通道蛋白在發(fā)育中的時空表達(dá)及其意義,我們通過免疫熒光

10、染色對胚胎期和出生后的小鼠各個時期牙胚進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)Piezo1和2從E16.5到PD7的牙胚發(fā)育及牙本質(zhì)形成早期均無明顯表達(dá)。初步懷疑:Piezos是在成牙本質(zhì)細(xì)胞的中晚期才開始表達(dá),而再其初期,成牙本質(zhì)細(xì)胞并不具備壓力感受性,故而相關(guān)的壓力感受器還沒有表達(dá)。
　　進(jìn)一步的實驗發(fā)現(xiàn):通過對牙髓干細(xì)胞礦化誘導(dǎo)和神經(jīng)向誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)礦化誘導(dǎo)21天后,免疫細(xì)胞熒光染色發(fā)現(xiàn) Piezo僅有非特異性的表達(dá),而使用缺氧腦組織勻漿誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向