雙歧桿菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中熱休克蛋白70及炎性因子表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s disease,CD),是具有慢性、復(fù)發(fā)性、組織破壞性的一組疾病,發(fā)病率及患病率呈逐年上升趨勢(shì),其病因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚,治療方法有限。近年來研究結(jié)果顯示,該類疾病與腸道細(xì)菌抗原及黏膜免疫系統(tǒng)紊亂密切相關(guān),因此理想的IBD動(dòng)物模型對(duì)IBD的研究意義重大。理論上

2、采用大鼠腸道的正常菌群為抗原誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型,比較接近于IBD自然病程。益生菌對(duì)IBD的作用機(jī)制是改變腸道微環(huán)境紊亂和直接或間接方式影響多種免疫細(xì)胞的功能。雙歧桿菌是人腸道正常菌群中占優(yōu)勢(shì)的益生菌,在腸道內(nèi)通過改變腸道菌群比例及誘導(dǎo)激活免疫反應(yīng),發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,且對(duì)宿主無毒副作用,適合長期服用。但在臨床應(yīng)用中多將傳統(tǒng)的治療藥物與其聯(lián)合應(yīng)用,單一用藥對(duì)IBD的是否存在預(yù)防及治療作用,且目前臨床研究結(jié)果基本不支持益生菌可有效治療CD,關(guān)于

3、益生菌對(duì)IBD的治療效應(yīng),尚有待進(jìn)一步觀察和評(píng)估。
　　目的：(1)以大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株和TNBS/乙醇兩種方法誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎,比較兩種方法優(yōu)劣,探討以大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株法造模的可行性及實(shí)用性。
　　(2)以此為基礎(chǔ),對(duì)大鼠 DAI,CMDI和 TDI進(jìn)行評(píng)分,檢測(cè)血清及組織中熱休克蛋白70(HSP70)、CC趨化因子配體20(CCL20)及其受體(CCR6)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)變化

4、;
　　(3)在已經(jīng)建立的大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株法模型上,以雙歧桿菌干預(yù),觀察上述指標(biāo)的變化,初步探討其作用的可能機(jī)制。為其在臨床上應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：分組:100只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)均分為正常組(N1組:觀察14d、N2組:觀察28d)、模型組(M11:大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株模型組觀察14d,M12:大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株模型組觀察28d;M21:TNBS/乙醇模型組觀察14d,TNBS/乙醇模型組觀察28d)、5-A

5、SA組(A組)及雙歧桿菌組(D1:造模前應(yīng)用觀察14d組,D2:造模前應(yīng)用觀察28d組,D3:造模后應(yīng)用觀察14d組)。
　　造模:大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株法制備結(jié)腸炎模型:大鼠結(jié)腸內(nèi)容物培養(yǎng)、擴(kuò)增及福爾馬林殺死細(xì)菌,并將細(xì)菌懸液濃度調(diào)為1.2×108/ mL,在大鼠足跖處注射細(xì)菌懸液0.2 mL,于第10、17、24天分別多點(diǎn)皮下注射0.4 mL、0.6 mL和1.2 mL;TNBS/乙醇法制備大鼠結(jié)腸炎模型:禁食不禁水24 h,麻醉后

6、,聚乙烯管插入直腸約8 cm,灌入含30 mg TNBS/500 mL/L乙醇1 mL,倒懸位持續(xù)30s,后取頭低尾高位20-30度。
　　處理:5-ASA組給予奧沙拉秦鈉膠囊100 mg/(kg·d),雙歧桿菌組給予雙歧桿菌0.1 ml/d(108 cfu/ml)。正常組與模型組給予生理鹽水2 ml/d,連續(xù)灌胃14 d、28d。造模成功后觀察造模后大鼠存活率,每日行DAI評(píng)分,分別于造模后第14天、第28天各處死一半大鼠,評(píng)價(jià)

7、CMDI及TDI,免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織HSP70,CCL20及CCR6的表達(dá),ELISA法檢測(cè)血清HSP70,CCL20及CCR6、IL-10和TNF-α含量。
　　結(jié)果：(1)大鼠結(jié)腸炎模型比較
　　①大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株法模型(M1組):分4次皮下注射細(xì)菌菌懸液共需24天,接受免疫的大鼠于第3周開始大便次數(shù)及性狀改變,伴有體質(zhì)量下降等,28~31 d達(dá)高峰,癥狀持續(xù)至處死前仍有隱血試驗(yàn)陽性。近肛門段結(jié)腸炎癥明顯,腸腔內(nèi)可見

8、多處大小約0.1~0.2cm似假性息肉樣微隆起性病變,潰瘍的形成。病理表現(xiàn)為黏膜及黏膜下層水腫,彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤,纖維組織增生等。
　?、?TNBS/乙醇法模型(M2組):一次性直腸內(nèi)注入TNBS/乙醇,造模24h后大鼠均出現(xiàn)精神萎靡,大便改變,體質(zhì)重下降等,3~7 d達(dá)到高峰,于第3天、第5天各死亡1只,大便隱血陽性持續(xù)至第14天,第21天始大鼠活動(dòng)逐漸正常,體質(zhì)重均較前有所增長。死亡的大鼠解剖觀結(jié)腸脾曲處與周圍組織嚴(yán)重黏連,

9、處死的部分大鼠出現(xiàn)腸梗阻,炎癥病變主要靠近肛門段結(jié)腸,黏膜充血水腫、糜爛,潰瘍形成,病理表現(xiàn)黏膜及黏膜下層炎細(xì)胞浸潤,腺管扭曲、排列紊亂等。
　?、塾^察14天模型組DAI、CMDI及TDI評(píng)分明顯高于正常組,DAI:(0.78±0.11vs0.00±0.00,1.85±0.18 vs0.00±0.00,P<0.05);CMDI:(5.40±1.07 vs0.00±0.00,6.00±1.15vs0.00±0.00,P<0.05);

10、TDI:(4.50±0.85 vs0.00±0.00,4.90±0.88vs0.00±0.00,P<0.05)。模型M11組,觀察14天DAI,CMDI及TDI評(píng)分低于觀察28天,DAI(0.78±0.11vs1.32±0.23,P<0.05),CMDI(5.40±1.07vs6.20±1.16,P<0.05),TDI(4.50±0.85vs5.70±0.82,P<0.05)。而模型M12組,觀察14天DAI,CMDI及TDI評(píng)分高于觀

11、察28天,DAI(1.85±0.18vs0.92±0.20,P<0.05),CMDI(6.00±1.15vs5.10±1.20,P<0.05),TDI(4.90±0.88vs3.40±0.97P<0.05)。觀察14天,模型M1組DAI評(píng)分低于模型M2組(0.78±0.11vs1.85±0.18,P<0.05),CMDI及TDI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CMDI(5.40±1.07vs6.00±1.15,P>0.05),TDI(4.50±0.8

12、5vs4.90±0.88,P>0.05)。觀察28天,模型M1組DAI,CMDI及TDI評(píng)分高于模型M2組,DAI(1.32±0.23vs0.92±0.20,P<0.05),CMDI(6.20±1.16vs5.10±1.20, P<0.05),TDI(5.70±0.82vs3.40±0.97,P<0.05)。
　　(2)結(jié)腸炎模型中大鼠結(jié)腸組織及血清中HSP70,CCL20及其受體CCR6,TNF-α,IL-10表達(dá)及含量的變化:

13、模型組大鼠結(jié)腸組織中及血清HSP70,IL-10表達(dá)明顯低于正常組,結(jié)腸組織HSP70(45.70±2.06 vs71.49±2.46,51.15±1.72vs71.49±2.46,P<0.05);血清HSP70(50.66±2.43vs70.26±3.38,53.96±2.85vs70.26±3.38,P<0.05);血清IL-10(59.96±8.25vs88.67±6.48,63.67±6.65vs88.67±6.48,P<0.0

14、5)。結(jié)腸組織及血清中CCL20、CCR6、TNF-α評(píng)分明顯高于正常組,結(jié)腸組織CCL20(288.07±25.57vs113.36±14.86,284.61±23.59vs113.36±14.86,P<0.05);血清CCL20(51.23±2.93vs37.30±1.13,48.62±4.82vs37.30±1.13,P<0.05);結(jié)腸組織CCR6(277.37±25.38vs183.09±14.67,270.29±36.83v

15、s183.09±14.67,P<0.05);血清CCR6(113.78±8.92vs57.94±6.43,116.92±8.17vs57.94±6.43,P<0.05);血清TNF-α(78.72±9.76vs27.49±4.41,78.78±8.45vs27.49±4.41,P<0.05)。
　　(3)雙歧桿菌組干預(yù)結(jié)果
　　①與模型M11組比較,雙歧桿菌應(yīng)用組(D3組)DAI,CMDI及TDI評(píng)分明顯減低,DAI(0.6

16、6±0.13vs0.78±0.11, P<0.05),CMDI(4.20±0.63vs5.40±1.07,P<0.05),TDI(3.60±0.84vs4.50±0.85,P<0.05),結(jié)腸組織及血清HSP70、IL-10表達(dá)明顯增高,結(jié)腸HSP70(68.55±1.22 vs45.70±2.06,P<0.05);血清HSP70(86.31±2.61 vs50.66±2.43,P<0.05);血清IL-10(90.13±7.71vs5

17、9.96±8.25,P<0.05)。結(jié)腸組織及血清中CCL20和CCR6,TNF-α表達(dá)明顯降低,結(jié)腸組織CCL20(192.08±18.33vs288.07±25.57,P<0.05);血清CCL20(38.54±1.71vs51.23±2.93,P<0.05);結(jié)腸組織CCR6(223.21±17.93vs277.37±25.38, P<0.05);血清CCR6(91.98±7.67vs113.78±8.92,P<0.05);血清T

18、NF-α(68.18±6.98vs78.72±9.76,P<0.05)。
　　②與雙歧桿菌造模后應(yīng)用組(D3組)比較,雙歧桿菌造模前應(yīng)用觀察14天組(D1組)DAI,CMDI及TDI評(píng)分低,DAI(0.51±0.26 vs0.66±0.13,P<0.05);CMDI(2.90±0.88 vs4.20±0.63,P<0.05);TDI(2.60±0.84vs3.60±0.84,P<0.05)。與D3組比較,D1組結(jié)腸組織及血清HSP

19、70、IL-10表達(dá)高,結(jié)腸組織HSP70表達(dá)(81.37±1.73vs68.55±1.22, P<0.05);血清HSP70(100.07±2.06vs86.31±2.61,P<0.05);血清IL-10(116.03±9.08vs90.13±7.71 P<0.05)。結(jié)腸組織CCL20(169.42±15.58vs192.08±18.33,P<0.05);與D3組比較, D1組結(jié)腸組織及血清中CCL20和CCR6,TNF-α表達(dá)低,

20、血清CCL20(25.42±1.97vs38.54±1.71,P<0.05);結(jié)腸組織CCR6(201.62±17.20vs223.21±17.93,P<0.05);血清CCR6(74.43±8.01vs91.98±7.67,P<0.05);血清TNF-α(55.08±8.16vs68.18±6.98,P<0.05)。
　　(4)雙歧桿菌應(yīng)用觀察14天組DAI,CMDI及TDI評(píng)分,結(jié)腸組織及血清中CCL20及其受體CCR6、TN

21、F-α含量高于觀察28天組,DAI(0.51±0.26vs0.52±0.21,P>0.05);CMDI(2.90±0.88vs2.70±0.82,P>0.05);TDI(2.60±0.84vs2.40±0.70,P>0.05);結(jié)腸組織CCL20(169.42±15.58vs162.07±20.11,P>0.05);血清CCL20(25.42±1.97vs23.35±1.06,P>0.05);結(jié)腸組織CCR6(201.62±17.20

22、vs189.56±16.64,P>0.05);血清CCR6(74.43±8.01 vs73.51±7.86,P>0.05);血清TNF-α(55.08±8.16 vs51.89±8.01,P>0.05);結(jié)腸組織及血清中HSP70和IL-10含量低于觀察28天,結(jié)腸組織HSP70(81.37±1.73vs83.36±1.66,P>0.05),血清HSP70(100.07±2.06vs100.82±2.91,P>0.05),血清IL-10

23、(116.03±9.08vs120.69±8.06,P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株法模型從病變發(fā)展過程、病程及病理改變情況上看采用大鼠的正常菌群為抗原,比較接近于 IBD慢性炎癥病程,但該模型操作步驟復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)周期長;TNBS/乙醇法模型造模周期短,造模成功率高,急性期炎癥明顯。兩種模型從不同的免疫學(xué)角度探討 IBD病因和發(fā)病機(jī)制,各有不同用途。大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株法模型對(duì)闡明體液免疫和細(xì)胞免疫在不同類