雙歧桿菌對(duì)新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸道粘膜Toll樣受體2、4、9的表達(dá)影響.pdf

1、第一部分：雙歧桿菌對(duì)新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎癥狀及腸道組織形態(tài)學(xué)影響
　　目的：研究雙歧桿菌對(duì)新生鼠NEC模型中新生鼠的癥狀及腸道組織形態(tài)學(xué)影響。為在新生兒NEC治療中使用雙歧桿菌提供基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究依據(jù)。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：生后24小時(shí)內(nèi)的36只新生鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、治療組。對(duì)照組：不添加雙歧桿菌，不進(jìn)行NEC造模；實(shí)驗(yàn)組：進(jìn)行NEC造模；治療組：在進(jìn)行NEC造模的同時(shí)添

2、加雙歧桿菌。
　　2、雙歧桿菌的添加方法：在鼠配方奶中添加雙歧桿菌，濃度為1*108cfu/ml,劑量為2次/日。
　　3、NEC造模方法：對(duì)進(jìn)行造模的新生鼠進(jìn)行人工喂養(yǎng)（6次/日），100％氮?dú)馊毖?0秒，4℃冷刺激10分鐘，每日2次，連續(xù)滿3天。
　　4、組織獲取：建模結(jié)束后立即處死小鼠，在距盲腸0.5cm處，取遠(yuǎn)端回腸組織長(zhǎng)度約0.5cm置于中性甲醛中固定，石蠟包埋制作病理切片。
　　5、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)：各組

3、新生鼠實(shí)驗(yàn)前后的生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)變化；新生鼠發(fā)生NEC的癥狀比較；NEC的發(fā)病率；H.E染色下腸道粘膜組織病理學(xué)評(píng)分。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間的比較采用方差分析，發(fā)生率比較采用Χ2檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)組體重增長(zhǎng)低于對(duì)照組及治療組（﹣0.28±0.05 VS2.16±0.28 VS0.56±0.07），三組間體重

4、變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組身長(zhǎng)增長(zhǎng)（0.35±0.14）低于另外兩組，治療組身長(zhǎng)增長(zhǎng)（0.71±0.02）低于對(duì)照組（1.23±0.06）而高于實(shí)驗(yàn)組，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.實(shí)驗(yàn)組發(fā)生腹脹、便血等NEC臨床癥狀發(fā)生率為50%，治療組為20%，對(duì)照組則無NEC臨床癥狀，實(shí)驗(yàn)組高于治療組，兩者間比較（χ2=2.00）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.實(shí)驗(yàn)組NEC發(fā)病率為58.3

5、3%，對(duì)照組為0%，治療組為33.33%，治療組發(fā)病率低于實(shí)驗(yàn)組，比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（P<0.05）三組腸道粘膜組織病理學(xué)平均評(píng)分分別為：實(shí)驗(yàn)組為1.75±0.75，治療組為0.83±0.71，對(duì)照組為0?？梢妼?shí)驗(yàn)組的病理學(xué)損傷最嚴(yán)重（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.雙歧桿菌可有效減輕新生鼠NEC造成的生長(zhǎng)發(fā)育的遲緩。
　　2.使用雙歧桿菌可減輕新生鼠NEC引起的腹脹，便血的癥狀。
　　3.添加雙歧桿菌可

6、減少新生鼠NEC的發(fā)病率，減輕其病理學(xué)變化的嚴(yán)重程度。
　　第二部分：雙歧桿菌對(duì)新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸道粘膜TLR2、TLR4、TLR9表達(dá)變化
　　（一）、雙歧桿菌對(duì)新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸道粘膜TLR2、TLR4、TLR9表達(dá)變化
　　目的：
　　通過熒光定量PCR方法檢測(cè)添加雙歧桿菌影響新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎的腸道粘黏膜組織中TLR2、TLR4、TLR9的表達(dá)量。為了解雙歧桿菌對(duì)NEC的保護(hù)作用機(jī)制提供分

7、子生物學(xué)研究。
　　方法：
　　使用第一部分實(shí)驗(yàn)各組獲得的新生鼠的回盲部腸道組織進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)組織中TLR2、TLR4、TLR9mRNA的表達(dá)量。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　以對(duì)照組為參照，TLR2在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量是它的0.48倍，治療組是它的2.49，治療組表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)組；TLR4在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)量為對(duì)照組的3.48倍，治療組中的表達(dá)量是其1.

8、25倍，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量高于治療組；TLR9表達(dá)量是對(duì)照組的0.47倍，治療組中表達(dá)量是對(duì)照組的4.00倍，治療組表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組。以上各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　雙歧桿菌減少NEC發(fā)病率及損傷可能與其能增加TLR2、TLR9表達(dá)，而降低TLR4的表達(dá)相關(guān)。
　　（二）、雙歧桿菌在新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎病理損傷發(fā)生前對(duì)中腸道粘膜組織的TLR2、TLR4、TLR9表達(dá)影響
　　目的：

9、　　研究雙歧桿菌在新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎病理損傷發(fā)生前對(duì)TLR2、TLR4、TLR9的表達(dá)量影響，為應(yīng)用雙歧桿菌預(yù)防NEC疾病的發(fā)病提供分子生物學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　45只出生24小時(shí)內(nèi)的新生鼠隨機(jī)分為三組，分別是對(duì)照組（n=15）、實(shí)驗(yàn)組（n=15）、治療組（n=15）。各組處理方式與第一部分一致，分別于NEC造模過程中的24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)中每組處死5只新生鼠。用qRT-PCR方法測(cè)量獲取腸道組織中TLR2、

10、TLR4、TLR9的表達(dá)量。比較在不同時(shí)間段三中基因表達(dá)量的變化過程。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　各組TLR2表達(dá)在24小時(shí)內(nèi)的差異變化不大（P>0.05）；48小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組的TLR2mRNA是對(duì)照組的1.07倍，治療組是3.75倍，治療組高于實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）；72小時(shí)后可見治療組TLR2表達(dá)量（對(duì)照組的5.97倍）高于實(shí)驗(yàn)組（對(duì)照組的0.72倍）。在24小時(shí)內(nèi)

11、TLR4的表達(dá)量在三組間無明顯差異（P<0.05）；48小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量是對(duì)照組的3.45倍，而治療組是對(duì)照組的1.33倍，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量高于另兩組；在72小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組TLR4表達(dá)量是對(duì)照組的8倍遠(yuǎn)高于治療組（對(duì)照組的2.02倍），兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TLR9的表達(dá)在24小時(shí)內(nèi)三組無明顯差異（P>0.05）；48小時(shí)后治療組增高，表達(dá)量是對(duì)照組的3.44倍高于另外兩組的表達(dá)量，組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；72小時(shí)后治療