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文檔簡介
1、壞死性小腸結腸炎(Necrotizing enterocolitis, NEC)是新生兒嚴重的腸道炎癥性疾病,大多發(fā)生在早產(chǎn)兒,特別是極低出生體重兒(Very low birth weight, VLBW)。嚴重的 NEC可能需要手術干預,而手術干預的 NEC患兒死亡率較高。另外術后除了容易發(fā)生短腸綜合征、消化不良等并發(fā)癥外,還會導致神經(jīng)發(fā)育障礙。目前認為 NEC與早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、腸道過激炎癥反應等有關,然而確切的發(fā)病機制目前不太清楚。
2、Toll樣受體( Toll like receptors,TLRs)是一類跨膜受體,通過識別相應的病原相關模式分子( Pathogen associated molecular pattern, PAMP)然后釋放信號,是先天免疫的重要組成。目前發(fā)現(xiàn) TLR4信號與 NEC發(fā)病關系密切。適當?shù)?TLR4信號釋放對腸道的免疫反應以及腸道發(fā)育是有益的,然而過度的 TLR4信號釋放會引起腸道嚴重炎癥反應,最終引起 NEC。Toll作用蛋白(
3、Toll interacting protein, TOLLIP)及單 Ig區(qū) IL-1相關受體( Single Ig IL-1-related receptor, SIGIRR)是 TLR4信號中的抑制因子, TOLLIP和 SIGIRR可以減輕TLR4的信號傳遞,減輕炎癥反應。
雙歧桿菌是益生菌中的一種,是腸道優(yōu)勢菌群之一。雖然隨機對照試驗( Randomized controlled trials, RCTs)發(fā)現(xiàn)雙歧桿
4、菌可以有效預防早產(chǎn)兒發(fā)生 NEC發(fā)生,但是雙歧桿菌預防 NEC的效果一直存在爭議,雙歧桿菌預防 NEC的作用機制尚未清楚。本文旨在研究雙歧桿菌對新生 SD大鼠壞死性小腸結腸炎動物模型的影響并從雙歧桿菌對 TLR4、TOLLIP和 SIGIRR基因表達的調節(jié)方面闡明可能的機制。
目的:研究雙歧桿菌對新生 SD大鼠 NEC模型腸道損傷的保護作用,并探討雙歧桿菌對 TLR4、TOLLIP和 SIGIRR mRNA表達的影響,探討雙歧
5、桿菌保護腸道損傷的可能機制。
方法:(1)實驗動物分組:成年 Specific pathogen free(SPF)級雄性及雌性 SD大鼠分別3只和6只,按照雄雌比例1:2合籠。合籠第二天清晨檢查雌性 SD大鼠在是否有陰道栓確定為妊娠第0天。在孕21天剖腹獲取早產(chǎn)新生 SD大鼠45只。將45只新生大鼠隨機分成正常組( n=14)、NEC組( n=16)和干預組( n=15)。(2)NEC動物模型建立:正常組新生 SD大鼠交由近
6、日生育的母鼠代乳。NEC組及干預組的新生 SD大鼠采用 Esbilac動物配方奶進行人工喂養(yǎng)。首次在生后2h后開始,每次喂養(yǎng)量為0.15ml,之后每4h一次,24h后增加至0.2ml/次。NEC組和干預組新生 SD大鼠在進食第一餐后開始造模。將新生SD大鼠置入缺氧箱中,調節(jié)氮氣流量為15 L/min往缺氧箱內通氣,當測氧儀下降至0時開始計時,90 s后結束氮氣通氣并打開缺氧箱。隨后將新生大鼠置入4℃冰箱冷藏室中,持續(xù)10 min。每日進
7、行缺氧和冷刺激2次,2次間隔12h,連續(xù)72h。(3)干預方法:每日往干預組新生 SD大鼠的配方奶中添加2次雙歧桿菌,每次1×108cfu,兩次間隔12h。 NEC組和正常組無添加雙歧桿菌。(4)標本采集:生后72h采取頸椎脫臼法處死三組新生大鼠,對腹部進行解剖。取出十二指腸至回盲部的腸管。取近回盲部2cm腸管分別置于中性甲醛溶液和-70℃保存。(5)觀測指標:各組新生大鼠一般表現(xiàn)、體重變化、72h存活率、腸道病理評分、NEC發(fā)生率,采
8、用熒光定量 PCR方法檢測 TLR4、TOLLIP及 SIGIRR mRNA表達并進行組間比較。
結果:(1)正常組新生大鼠活力佳,叫聲響,無黏液血便和腹脹等 NEC表現(xiàn)。NEC組新生大鼠活動少,叫聲弱,大部分出現(xiàn)黏液血便及腹脹等 NEC表現(xiàn)。干預組情況好于 NEC組但弱于正常組,出現(xiàn)腹脹、便血等 NEC表現(xiàn)較輕。(2)正常組新生大鼠72h內體重逐漸增長( P<0.05),NEC組新生大鼠體重逐漸減輕( P<0.05),干預組
9、體重沒有顯著改變(P>0.05)。(3)NEC組72h存活率56%(9/16),干預組87%(13/15),正常組100%,干預組與 NEC組存活率差異有統(tǒng)計學意義( P<0.05)。(4)正常組、NEC組和干預組腸道病理評分分別為0分、(2.4±1.0)分和(1.3±0.6)分,干預組與 NEC比較,腸道病理評分降低( P<0.05)。(5)正常組、NEC組和干預組 NEC發(fā)生率分別為0(0/14)、78%(7/9)和23%(3/13
10、),干預組與 NEC比較,NEC發(fā)生率降低( P<0.05)。(6)正常組、NEC組和干預組 TLR4 mRNA相對表達量分別為1.00±0.38、3.64±1.73和1.78±0.70;TOLLIP mRNA相對表達量分別為1.00±0.85、0.23±0.15和0.86±0.62;SIGIRR mRNA相對表達量分別為1.00±0.58、0.27±0.12和0.71±0.49。NEC組 TLR4 mRNA表達高于正常組, TOLLI
11、P以及 SIGIRR mRNA表達低于正常組( P均<0.05)。干預組 TLR4 mRNA表達低于 NEC組,TOLLIP和 SIGIRR mRNA表達高于 NEC組( P均<0.05),但與正常組進行比較,TLR4、TOLLIP和 SIGIRR mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義( P分別為0.63、0.614和0.146)。
結論:早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)及缺氧冷刺激可誘導新生大鼠腸組織產(chǎn)生接近人類新生兒 NEC樣病理改變。NEC發(fā)生機
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