核因子κB在腎小球硬化中的作用及反義核酸的干預.pdf

1、目的：從分子水平探討腎小球硬化的發(fā)病機制，觀察。腎小球硬化大鼠蛋白尿等腎病表現及腎組織病理改變，從蛋白水平分析腎小球硬化相關因子的作用以及NF-кB與腎小球硬化、細胞凋亡的關系。應用反義寡核苷酸技術抑制腎組織NF-кB的基因翻譯表達，觀察對腎小球硬化的保護作用，為合理應用反義寡核苷酸技術提供理論和實驗依據。 方法：將45只SD大鼠右側腎切除加尾靜脈注射阿霉素 (6mg/kg)制作腎小球硬化大鼠模型，隨機分成四大組：病理模型組(B

2、組，9只)，正義核酸組(C組，12只)，無義核酸組(D組，12只)，反義核酸組(E組，12只)。其中C、D、E組三組又各自分成兩小組，分別為：C1組，正義核酸組6只；C2組，正義核酸+脂質體組6只。D1組，無義核酸組6只；D2組，無義核酸+脂質體組6只。E1組，反義核酸組6只；E2組，反義核酸+脂質體組6只。另9只為假手術組(A組)，假手術1周后，給予尾靜脈注射0.4ml生理鹽水。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水及飲食，共8周。8周后C1、D1、

3、E1、C2、D2、E2組分別給予不同的藥物干預，A、B組分別給予等量的5％GS。 分別在三個不同的時間點：A時間點(建模8周)、B時間點(給藥3天后)、C時間點(給藥7天后)留取血、尿標本測定血白蛋白(ALB)、膽固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)，測定24h尿蛋白排泄量。腎臟標本部分放置于10％福爾馬林液，部分分離腎皮質，一70℃保存。 用Western-blot檢測腎皮質TGF-β1、磷酸化NF-кBp

4、65的蛋白表達；免疫組化檢測腎組織活化NF-кBp65、Caspase-3的表達及分布；TUNEL 檢測腎小球細胞凋亡；ELISA方法測定血清IL-6、TNF-α水平。HE染色觀察腎組織形態(tài)學變化，利用圖像分析系統(tǒng)計算腎小球硬化指數(GI)。數據以均數±標準差(s±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多樣本均數間的多重比較采用LSB-t檢驗，等級資料采用非參數檢

5、驗。變量間關系采用直線相關分析，P<0.05有統(tǒng)計學意義。 結果： 1．生化改變 在A時間點，B組出現明顯蛋白尿，血白蛋白下降及CHOL、BUN升高，與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 在B時間點，與B組比較，E2組的尿蛋白、CHOL、BUN降低56％、42％、71％。E1組尿蛋白、CHOL 與B組比較降低40％，57％，差異均有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。 在C時間點，與B組比較，

6、E2組的尿蛋白、CHOL、BUN降低65％、38％、46％，血白蛋白升高23％，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。E1組除CHOL有所升高外，其余指標與B組比較無差異(P>0.05)。 2．病理結果 A組腎小球及腎小管間質結構基本正常。B組部分腎小球出現節(jié)段性硬化，多數呈現節(jié)段性系膜細胞和基質增生、玻璃樣變性、泡沫細胞的增多或伴有球囊粘連、囊腔擴大，部分腎小球呈現代償性肥大。腎小管上皮細胞變性，多灶性萎縮，部分代償性肥

7、大，蛋白管型，腎間質纖維化，彌漫性炎癥細胞浸潤。隨著時間的推移，硬化的腎小球數目逐漸增多，硬化面積逐漸擴大，出現較多的全腎小球硬化，硬化指數(GI)C時間點分別是B時間點、A時間點的1.11、1.28倍。E2組病理改變明顯輕于B組。E1組在B時間點與B組相比，病理改變有所減輕，GI值比B組減少33％；但在C時間點與B組相比無差異。其余各干預組病理改變與B組大致相同，GI值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 3．腎皮質TGF-β1

8、、磷酸化NF-кBp65的蛋白表達 A時間點，B組TGF-β1、NF-кBp65的蛋白表達比A組升高2.75、6.87倍。B時間點，E2組 TGF-β1、NF-кBp65蛋白表達比B組降低43％、60％。C時間點，E2組TGF-β1、NF-кBp65蛋白表達比B組降低了53％、56％，所有差異均有統(tǒng)計學意義核因子кB在腎小球硬化中的作用及反義核酸的干預(P<0.05)。而E1組FGF-β1、NF-кBp65蛋白表達與B組比較，只

9、在B時間點有降低，C時間點無差異。 4．腎小球Caspase-3、活化NF-кBp65的表達 A時間點，B組的Caspase-3、NF-кBp65陽性表達指數分別是A組的2.86、3.55倍。B時間點，E2組Caspase-3表達比B組減少47％，E1組則與B組無差異；E1、E2組NF-кBp65表達比B組減少了51％、55％。C時間點，E2組Caspase-3、NF-кBp65的表達量與B組相比分別減少了34％、52％

10、；而E1組兩因子的表達量與B組無差異。 5．腎小球凋亡指數的比較 在A時間點，B組凋亡指數比A組明顯增多，是A組的12.2倍。B時間點，E1、E2組凋亡指數比B組減少27％、61％，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。C時間點，E2組凋亡指數比B組減少41％，而E1組則與B組無差異。 6．血清IL-6、TNF-α的表達 在各時間點，與A組比較，B組IL-6、TNF-α的表達均明顯升高。E2組IL-6、TNF

11、-α的表達與B組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而E1組IL-6、TNF-α的表達與B組比較，只在B時間點有降低，C時間點無差異。 7．直線相關分析 尿蛋白、GI、TGF-β1、Caspase-3、腎小球凋亡細胞數及IL-6、TNF-α的表達均與NF-кBp65呈正相關。 結論：系膜細胞的增殖與凋亡、炎癥因子 TGF-β1、IL-6、TNF-α的表達上調均與硬化有密切關系。NF-кB的活化參與炎癥