甘草甜素對(duì)腎小球硬化早期防護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：兒童腎病綜合征(NS)發(fā)病機(jī)制仍未闡明，此病預(yù)后導(dǎo)致腎小球硬化以致腎功能衰竭。腎小球硬化以腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量積聚為特征。TGFβ1、CTGF和MMPs/TIMPs等參與腎小球疾病的演變過(guò)程，促進(jìn)ECM積聚，造成腎小球硬化。因此，阻斷參與腎小球硬化的細(xì)胞因子和ECM的積聚是防止腎小球硬化進(jìn)展的關(guān)鍵。采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法，以阿霉素大鼠腎小球硬化模型為研究對(duì)象，觀察甘草甜素對(duì)TGFβ1、CTGF及TIMP

2、1的作用及其分泌ECM的影響；同時(shí)觀察甘草甜素對(duì)腎小球硬化模型形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)及血液生化變化的影響，提供甘草甜素對(duì)腎小球硬化早期防護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分包括：層粘連蛋白(LN)、纖維連接蛋白(FN)、Ⅳ型膠原(ColⅣ)。相關(guān)細(xì)胞因子如：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)。 方法：采用阿霉素(ADR)兩次注射法，建立大鼠腎小球硬化的

3、模型。實(shí)驗(yàn)分為三組，(1)對(duì)照組；(2)模型組；(3)治療組。模型組和治療組分別于第二次注射ADR后和第一次注射ADR后每天一次甘草甜素灌胃，并于第二次注射ADR后，同時(shí)觀察2、4、6和8周各項(xiàng)指標(biāo)的變化。包括①24h尿蛋白定量，收集血液標(biāo)本檢測(cè)血漿白蛋白(Alb)、膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)。②各組大鼠取腎皮質(zhì)進(jìn)行光鏡(HE、PAS、Masson染色)及電鏡等組織病理學(xué)檢測(cè)。③免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腎皮質(zhì)部LN、F

4、N、ColⅣ、TGFβ1、CTGF和TIMP-1蛋白的表達(dá)。④提取腎皮質(zhì)部的總RNA，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)部TGFβ1、CTGF和TIMP-1的mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：1.24h尿蛋白定量及血液生化的變化(1)模型組，第2、4、6和8周24h尿蛋白定量、血膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)均比對(duì)照組明顯升高，各時(shí)間點(diǎn)水平依次升高，并且有顯2著性差異(p＜0.05)。血漿白蛋白(Alb)各時(shí)間點(diǎn)

5、水平依次降低，并且有顯著性差異(p＜0.01)。說(shuō)明動(dòng)物模型臨床表現(xiàn)為腎病綜合征，并逐漸加重并發(fā)展為腎功能衰竭。 (2)治療組，24h尿蛋白定量、血膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)及血漿白蛋白(Alb)與模型組相比較均有不同程度改善。說(shuō)明GL在一定程度上可以降低蛋白尿，改善高脂血癥，對(duì)腎功能有保護(hù)作用。 2.組織病理學(xué)變化(1)模型組，光鏡下經(jīng)HE、PAS和Masson染色可見(jiàn)，2周時(shí)系膜細(xì)胞數(shù)量增多，4

6、周后系膜細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性；6周后出現(xiàn)局灶節(jié)段性腎小球硬化；8周后80％腎小球內(nèi)出現(xiàn)玻璃樣變，腎小管萎縮呈腎小球硬化的改變。電鏡下超微結(jié)構(gòu)見(jiàn)系膜細(xì)胞增生，線粒體腫脹，足突融合，基底膜部分增寬。6到8周足突融合加重，核漿比例失常，核內(nèi)染色質(zhì)疏松，電子致密物沉積，系膜基質(zhì)增寬加重，在ECM中見(jiàn)到絲狀的膠原物質(zhì)。 (2)治療組，光鏡下2周時(shí)細(xì)胞數(shù)目增加不明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)輕微。4周時(shí)空泡變性明顯輕于模型組。6～8周有部分局灶節(jié)段性腎小球

7、硬化；硬化指數(shù)高于對(duì)照組(p＜0.01)，但輕于模型組(p＜0.01)。電鏡下可見(jiàn)系膜細(xì)胞輕度增生，線粒體腫脹減輕，足突部分融合，基底膜輕度均勻增厚。6到8周后，足突仍見(jiàn)部分融合，核漿比例基本正常，核內(nèi)染色質(zhì)輕微變化，少量電子致密物沉積，但系膜基質(zhì)增寬程度輕于模型組。ECM中絲狀膠原物質(zhì)少于模型組。說(shuō)明甘草甜素可以改善腎臟組織的病理學(xué)變化，延緩腎小球硬化的進(jìn)展。 3.ECM和TGFβ1、CTGF蛋白的變化(1)模型組，正常腎小球

8、內(nèi)LN、FN和ColⅣ為弱陽(yáng)性表達(dá)，隨著腎小球硬化的程度逐漸加重，腎小球內(nèi)LN、FN和ColⅣ蛋白出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；在完全硬化失去正常結(jié)構(gòu)的腎小球，則全部被ECM成分LN、FN和ColⅣ所占據(jù)。同時(shí)TGFβ1和CTGF在腎小球硬化早期為弱陽(yáng)性表達(dá)，4～6周出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；但TGFβ1蛋白表達(dá)4周達(dá)高峰，而CTGF蛋白表達(dá)6周時(shí)達(dá)高峰。 (2)治療組，治療后LN、FN、ColⅣ、TGFβ1和CTGF蛋白表達(dá)較模型組有所減輕，但仍高于

9、對(duì)照組。說(shuō)明甘草甜素可以減少ECM的沉積，使TGFβ1和CTGF蛋白表達(dá)下降，延緩腎小球硬化進(jìn)展。 34.TGFβ1、CTGF和TIMP-1mRNA表達(dá)水平的變化(1)模型組，TGFβ1、CTGF和TIMP-1mRNA的表達(dá)逐漸增加，TGFβ1表達(dá)4周達(dá)高峰，CTGF和TIMP-1mRNA的表達(dá)6周達(dá)高峰。 (2)治療組，TGFβ1、CTGF和TIMP-1mRNA表達(dá)與模型組相比均有不同程度降低，表達(dá)峰值下降，但高于對(duì)照