海棲熱袍桿菌來(lái)源的極耐熱堿性果膠裂解酶的表達(dá)、純化及定性.pdf

1、果膠酶在工業(yè)領(lǐng)域是一種重要的新興酶類，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中的果汁制造和果酒釀造，在飼料加工、環(huán)境保護(hù)、誘導(dǎo)植物抗病等方面都有重大的應(yīng)用價(jià)值。近幾年發(fā)現(xiàn)果膠裂解酶是一種重要的清潔生產(chǎn)用酶，主要運(yùn)用于紙漿漂白和紡織品的生物精煉等行業(yè)，用于替代傳統(tǒng)的紡織精煉，通過(guò)酶解精煉的方法解決環(huán)境和能源等問(wèn)題，在質(zhì)量與環(huán)保方面都具有傳統(tǒng)工藝無(wú)法相比的優(yōu)點(diǎn)。隨著果膠裂解酶的新用途的不斷出現(xiàn)，因此該酶是近年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)課題。
　　 本文將來(lái)源于極

2、端嗜熱菌屬海棲熱袍桿菌Thermotoga maritima MSB8的編碼的果膠裂解酶的結(jié)構(gòu)基因pelA與新型熱激質(zhì)粒pHsh 連接，得到重組質(zhì)粒pHsh-pelA，運(yùn)用mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)pHsh-pelA的翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和優(yōu)化，得到了具有最佳mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)及自由能的質(zhì)粒pHsh-pelC。將重組質(zhì)粒pHsh-pelC 轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109(DE3)進(jìn)行表達(dá)，得到了一種極耐熱性堿性果膠裂解酶(PelC

3、)。對(duì)重組菌(pHsh-pelA)產(chǎn)生的重組果膠裂解酶進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)熱處理、DEAE-Sepharose FF 離子交換層析兩步共9.4倍的純化最終得到電泳純級(jí)的蛋白，并對(duì)純酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。
　　 對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適反應(yīng)溫度為90 ℃，最適反應(yīng)pH 為8.5，在pH 8.2～9.8 之間酶活力穩(wěn)定，95 ℃酶活半衰期為2 h，并且該酶依賴Ca 2+作為活性離子。在工業(yè)生產(chǎn)常用溫度60 ℃下，該酶能夠長(zhǎng)