海棲熱袍菌葡聚糖內切酶的克隆表達及酶學活性研究.pdf

1、光合作用產生的生物質是地球上最豐富的可再生資源，纖維素酶是一類能夠降解纖維素的糖苷水解酶，在生物質降解與轉化過程中具有關鍵作用。同時，纖維素酶在紡織品加工、紙漿脫墨、飼料和洗滌劑工業(yè)具有廣泛的用途。目前市場上的纖維素酶生產成本高、降解效率偏低，難以在工業(yè)上進行大規(guī)模的應用。提高降解效率和降低酶的應用成本的最有效策略是開發(fā)應用嗜熱微生物產生的高溫酶，實現(xiàn)催化活性的提高和使用壽命的延續(xù)。海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）是

2、一株極端嗜熱的厭氧細菌，最適生長溫度達到80℃，表現(xiàn)出極強的纖維素水解能力；對其基因組研究發(fā)現(xiàn)，它的基因組中與糖、多糖代謝有關的編碼基因占7％，遠遠高于其他已經測序的真細菌和古菌，其基因組中存在大量的多聚糖水解酶的編碼序列。本研究，運用基因工程技術研究海棲熱袍菌葡聚糖內切酶（endoglucanase，EG，簡稱纖維素酶）的高效表達技術，鑒定它們的酶學性質及相互協(xié)同作用。主要研究內容與研究結果如下：
　?。?）運用基因工程技術研究

3、纖維素酶在大腸桿菌中的超量表達技術。以海棲熱袍菌基因組為模板，PCR擴增8個編碼不同纖維素酶的基因的成熟肽序列；將PCR產物與大腸桿菌新型熱激表達載體pHsh連接，構建重組表達質粒pHsh-EGs。通過反向PCR技術克隆得到載體片段，在N端起始密碼子后修改或插入密碼子以提高表達水平。來自同1個菌株的8個被標注為纖維素酶的基因得到成功克隆，并在pHsh載體中得到了有效表達。
　?。?）對重組纖維素酶進行純化和酶學性質鑒定。超聲破碎細

4、胞后獲取粗酶液；通過熱處理和鎳親和層析兩步法使8種重組酶達到電泳純。對8種酶的活性進行的初步鑒定表明，Tma-EG12A、Tma-EG12B、Tma-EG5A和Tma-EG74表現(xiàn)出超強的纖維素水解能力；而Tma-EG5B、Tma-EGA、Tma-EGB和Tma-EGC只有微弱的CMC活性。本論文對Tma-EG12A、Tma-EG12B、Tma-EG5A和Tma-EG74進一步進行了酶學性質的鑒定，它們的最適反應溫度依次為95℃、90℃

5、、85℃和85℃，最適反應pH分別為5.6、5.6、5.2和5.2，四個纖維素內切酶有很好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，比酶活分別為55.5、213.5、31和4.5U/mg。
　?。?）一種新型甘露聚糖酶的發(fā)現(xiàn)和定性。Tma-EG5B在海棲熱袍菌基因組中被標注為纖維素酶（β-1,4-葡聚糖酶），國外的研究報道認為它是地衣多糖酶（β-1,3-1,4-葡聚糖酶）。本論文研究發(fā)現(xiàn)它以甘露聚糖（β-1,4-甘露聚糖）為底物時，比酶活高達112