RDP-p53融合蛋白對小鼠IgG和炎癥細胞因子的影響.pdf

1、p53基因是重要的腫瘤抑制基因，其編碼的p53蛋白在細胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)和誘導(dǎo)細胞凋亡等方面均具有關(guān)鍵性作用，人類50％以上的腫瘤組織中存在p53基因突變，是所檢測到的最常見的基因突變，有研究人員指出，野生型p53蛋白功能的缺失是腫瘤發(fā)生的必要條件。將p53蛋白導(dǎo)入腫瘤細胞就可以發(fā)揮較好的的抗腫瘤功效，但是p53蛋白作為大分子物質(zhì)自身難以穿過細胞膜進入腫瘤細胞，使其應(yīng)用受到了一定限制。
　　Kumar等研究發(fā)現(xiàn)來源于狂犬病毒衣

2、殼糖蛋白的衍生肽段RDP(rabies virusglycoprotein derived peptide)能攜帶抗病毒的siRNA通過血腦屏障特異性地傳遞到感染了腦炎的小鼠腦中，大大提高患腦炎小鼠的存活率，并且RDP作為載體具有較高的安全性。Kumar等對RDP的開創(chuàng)性研究為解決大分子難以穿過細胞膜及血腦屏障入腦的問題提供了很好的基礎(chǔ)，我們實驗室前期成功利用RDP攜帶大分子蛋白質(zhì)BDNF快速特異性進入腦內(nèi)。以往研究中一般通過往細胞穿膜

3、肽（cell-penetrating peptides，CPP）攜帶大分子進入細胞，RDP多肽作為新型腦靶向遞藥載體克服了CPP無組織特異性的缺陷。
　　本實驗利用生物技術(shù)通過大腸桿菌表達RDP-p53融合蛋白，以期通過腦靶向遞藥載體RDP攜帶p53穿過血腦屏障，用于開發(fā)治療腦腫瘤比如神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新型藥物。生物技術(shù)藥物在體內(nèi)存在的最普遍的問題之一是免疫反應(yīng)，它不僅降低藥物療效，而且損害機體，免疫原性的評價成為闡明這些藥物臨床安全性

4、和有效性的關(guān)鍵因素，評價非期望出現(xiàn)的免疫原性是生物技術(shù)藥物臨床前和臨床評價的重要內(nèi)容。本實驗通過ELISA檢測血清IgG的水平來評價免疫原性的強弱。p53除具有抗腫瘤作用外，還與炎癥介質(zhì)之間存在一定聯(lián)系，p53可以影響炎癥細胞因子(inflammatory cytokine)的分泌;研究表明機體釋放的一系列炎癥細胞因子可以對藥物代謝酶的表達和功能產(chǎn)生調(diào)控，機體對藥物的處置過程會發(fā)生顯著改變。因此，炎癥細胞因子可能會影響RDP-p53融合

5、蛋白的藥理作用。本實驗通過ELISA檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α的水平來分析腹腔注射不同劑量的RDP-p53融合蛋白對小鼠血清炎癥細胞因子水平的影響，為研究RDP-p53融合蛋白抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥理作用奠定基礎(chǔ)。
　　實驗分兩部分進行:第一部分:以質(zhì)粒pET28a-p53為模板擴增p53基因，并克隆至原核表達載體pET28a-RDP中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET28a-RDP-p53，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta，IPTG誘

6、導(dǎo)表達蛋白并純化，SDS-PAGE確定該蛋白準確性。第二部分:將昆明小鼠分為空白對照組（等容生理鹽水）和RDP-p53融合蛋白高、中、低劑量(4 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg)組，經(jīng)腹腔注射免疫，每隔2d給藥1次，30 d后眼球取血，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中IgG和炎癥細胞因子（白細胞介素1β、白細胞介素6和腫瘤壞死因子α）的含量。
　　實驗結(jié)果:1雙酶切及測序結(jié)果顯示，p53基因已克隆入表達載體中;

7、RDP-p53融合蛋白在上清和沉淀中均獲得表達。2 ELISA測定結(jié)果表明:與對照組比較，低、中劑量組小鼠血清中IgG含量沒有明顯升高(P＞0.05），高劑量組顯著升高（P＜0.05）;與對照組比較，低、中劑量組小鼠血清炎癥因子水平?jīng)]有明顯變化(P＞0.05)，高劑量組的IL-1β和TNF-α含量顯著升高(P＜0.05)。
　　實驗結(jié)論:成功表達并純化RDP-p53融合蛋白，其免疫原性較弱且與給藥劑量相關(guān)，1mg/kg和2mg/k