卡介苗對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)細(xì)胞因子調(diào)控的研究.pdf

1、目的:
　　盡管經(jīng)過了一百年的研究，但是結(jié)核桿菌感染依然是全世界范圍內(nèi)健康的主要問題，并且是導(dǎo)致人們死亡的主要原因。每年有一千萬新的病例被診斷出來，有200萬人死于結(jié)核。結(jié)核的發(fā)病率增高和艾滋病人的增加相關(guān)連的，而且出現(xiàn)了很多耐藥的結(jié)核桿菌。通常來說，宿主的免疫系統(tǒng)可以抑制結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)，可以導(dǎo)致潛在的感染，是以在肉芽腫中存活的但不活躍的細(xì)菌為特點(diǎn)，世界三分之一的人口有結(jié)核的潛在感染，只有百分之十的人發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核。結(jié)核桿菌上

2、的抗原和巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體的結(jié)合可以導(dǎo)致這些細(xì)胞的活化和分泌細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答，并且可以啟動(dòng)獲得性免疫。結(jié)核菌感染后產(chǎn)生的細(xì)胞因子不總是對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，有一些對(duì)結(jié)核是有益的。
　　IL-12家族中的IL-23是由兩個(gè)亞基(p40和p19)組成的異源二聚體結(jié)構(gòu)，激活的抗原提呈細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-23，它對(duì)于維持體內(nèi)的Th17陽性細(xì)胞有重要作用，Th17細(xì)胞和腫瘤以及炎癥相關(guān)的疾病有其相關(guān)性

3、。本研究首先觀察BCG（卡介苗）接種后對(duì)相關(guān)T細(xì)胞亞群的影響，接著探討抗原提呈細(xì)胞在BCG刺激下所產(chǎn)生的促炎和抑炎因子，重點(diǎn)研究了BCG對(duì)IL-23的調(diào)控機(jī)制。通過上述研究可為臨床應(yīng)用奠定分子學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.小鼠BMDM（骨髓來源的巨噬細(xì)胞）的制備和培養(yǎng)。
　　2.BCG接種C57BL/6小鼠，收集淋巴結(jié)細(xì)胞檢測(cè)和感染相關(guān)的T細(xì)胞亞群。
　　3.用ELISA方法檢測(cè)BCG刺激后BMDM細(xì)胞培養(yǎng)上清液

4、中IL-12、IL-6、IL-10、IL-23和IL-1beta的量。
　　4.用ELISA方法檢測(cè)BCG刺激后RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-23的水平。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IL-23p19mRNA的表達(dá)情況。
　　5.針對(duì)IL-23p19DNA設(shè)計(jì)隨機(jī)引物，對(duì)BCG刺激后RAW264.7細(xì)胞做實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IL-23p19轉(zhuǎn)錄前的變化情況。
　　6.對(duì)RAW264.7細(xì)胞用BCG刺激后加入轉(zhuǎn)錄抑制劑5-甲基

5、苯并瞇唑(dichlorobenzimidazole)+放線菌素D(ACD)，阻止新的RNA產(chǎn)生，檢測(cè)兩組各時(shí)間點(diǎn)p19mRNA衰變情況。
　　7.用免疫印跡法檢測(cè)被刺激RAW264.7細(xì)胞中總p65和磷酸化p65的含量。
　　8.用不同濃度的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑SN50作用RAW264.7細(xì)胞后用BCG刺激，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組p19mRNA水平。
　　9.設(shè)計(jì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞使其高表達(dá)p65，

6、再BCG刺激細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組p19mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.C57BL/6小鼠分組給予BCG，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)淋巴結(jié)中細(xì)胞組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCG導(dǎo)致產(chǎn)生IFN-γ的CD4+T細(xì)胞、IL-17的CD4+T細(xì)胞數(shù)量、IFN-γ的CD8+T細(xì)胞數(shù)量均有增加。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)顯示BCG明顯增加小鼠BMDM對(duì)IL-12，IL-23，IL-1 beta，IL-6和IL-10的分泌。
　　3.小鼠

7、巨噬細(xì)胞系RAW264.7使用BCG刺激后明顯促進(jìn)IL-23的分泌，使IL-23p19mBNA表達(dá)明顯增加。
　　4.設(shè)計(jì)含有IL-23p19基因內(nèi)含子和外顯子的引物，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含量，發(fā)現(xiàn)BCG可以在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)了IL-23p19表達(dá)和降低了IL-23p19mRNA的衰變速度。
　　5.BCG刺激RAW264.7細(xì)胞，用免疫印跡法檢測(cè)出明顯提高磷酸化p65的含量，說明NF-κB通路在結(jié)核感染中發(fā)揮重

8、要作用。
　　6.不同含量NF-κB通路阻斷劑SN50作用后再用BCG刺激顯示p19mRNA的表達(dá)明顯下降。用對(duì)照質(zhì)粒和NF-κB p65質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后使用BCG刺激，實(shí)時(shí)定量PCR顯示高表達(dá)NF-κB p65的RAW264.7細(xì)胞在受BCG刺激后p19mRNA水平明顯升高。
　　結(jié)論:
　　1.BCG可以在小鼠中導(dǎo)致產(chǎn)生IFN-γ的CD4+T的升高，同時(shí)可以提高產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T細(xì)胞和Th