肺炎嗜衣原體CPAF重組蛋白致小鼠肺組織炎癥及對炎癥細胞因子影響的研究.pdf

1、目的:將本室構建的肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protease–like activity factor,CPAF)的181～400aa基因(CPAFm)的重組表達體在大腸桿菌中誘導表達,純化表達產(chǎn)物并進行鑒定,研究該重組蛋白在 BALB/c小鼠體內引起的肺部炎癥改變及對炎癥細胞因子TNF-α和IL-6的水平的影響,為進一步探索CPAF在Cpn感染中的致

2、病作用提供實驗依據(jù)。
　　方法:重組質粒pGEX6p-2/CPAFm,經(jīng)酶切和測序鑒定后,轉化至E.coli BL21中,IPTG誘導表達,采用SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達產(chǎn)物;復性后用谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase,GST)瓊脂糖凝膠FF純化重組蛋白,A280紫外分光光度法測定純化蛋白濃度。將純化的重組蛋白第1d、3d、6d鼻內或尾靜脈注射BALB/c小鼠,第7

3、d處死小鼠,HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學改變,常規(guī)血細胞計數(shù)法計外周血與支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)中白細胞總數(shù),瑞氏染色觀察外周血與BALF中白細胞分類計數(shù),ELISA方法檢測血漿和BALF中的TNF-α和IL-6的水平。
　　結果:重組目的基因表達菌在IPTG的誘導下,表達了相對分子質量(Mr)約51.3 kDa的目的蛋白,目的蛋白在菌體細胞內主要以包涵體形式存在,經(jīng)

4、GST瓊脂糖凝膠FF純化得到純度達95％以上的重組蛋白。重組蛋白能引起B(yǎng)ALB/c小鼠肺組織的炎癥病理損傷,光鏡下見BALB/c小鼠的肺組織出現(xiàn)中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤,對照組與正常組BALB/c小鼠肺組織未見明顯病理改變。尾靜脈注射實驗組的BALB/c小鼠外周血中性粒細胞比例明顯高于GST、PBS對照組和正常組(均P﹤0.01),單核細胞比例明顯高于GST對照組(P﹤0.05)、PBS對照組(P﹤0.05)和正

5、常組(P﹤0.01);鼻內滴入實驗組 BALB/c小鼠 BALF中白細胞總數(shù)明顯高于 GST對照組(P﹤0.05)、PBS對照組(P﹤0.05)和正常組(P﹤0.01);鼻內滴入實驗組外周血中炎癥因子IL-6水平顯著高于GST、PBS對照組和正常組(均P﹤0.01),TNF-α水平明顯高于GST對照組(P﹤0.05)、PBS對照組(P﹤0.01)和正常組(P﹤0.01);尾靜脈注射實驗組外周血中炎癥因子IL-6的水平明顯高于GST、PB

6、S對照組與正常組(均 P﹤0.01);鼻內滴入和尾靜脈注射實驗組 BALF中炎癥因子IL-6、TNF-α的水平明顯高于GST、PBS對照組與正常組(均P﹤0.01)。
　　結論:
　　1、成功表達純化得到51.3 kDa的GST-CPAFm重組蛋白和26kDa的GST蛋白;
　　2、GST-CPAFm重組蛋白能引起B(yǎng)ALB/c小鼠肺組織的炎癥病理損傷;
　　3、GST-CPAFm重組蛋白能引起B(yǎng)ALB/c小鼠體內