Oct-4作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定標(biāo)志物及其作用和機(jī)制研究.pdf

1、蘇州大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。論文作者簽名：碰日期：蘭翌!皇：丘fOct4作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定標(biāo)志物及其作用和機(jī)制研究中文摘

2、要Oct4作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定標(biāo)志物及其作用和機(jī)制研究中文摘要目的：1探討胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞分離純化、表型分析和生物學(xué)功能特性；2探討microRNA靶向調(diào)控胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞生長增殖作用；3探討Hedgehog信號通路參與胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞生長增殖調(diào)控機(jī)制。方法：1選取手術(shù)后新鮮胰腺癌組織標(biāo)本，提取和制備原代胰腺癌細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)。腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)分離胰腺癌細(xì)胞中干細(xì)胞樣細(xì)胞，并培養(yǎng)傳代，采用HE染色、細(xì)胞免疫熒光

3、鑒定。應(yīng)用原代胰腺癌細(xì)胞制備裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型用以富集腫瘤細(xì)胞。RealtimeRTPCR檢測胰腺癌細(xì)胞干細(xì)胞關(guān)鍵因子的表達(dá)。構(gòu)建質(zhì)粒載體使篩選的關(guān)鍵因子啟動子融合熒光蛋白轉(zhuǎn)染原代胰腺癌細(xì)胞并再次建立裸鼠皮下移植瘤模型。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析目標(biāo)因子陽性表達(dá)細(xì)胞含量及所占比例并進(jìn)行分選。通過MTT法測定細(xì)胞存活率，克隆形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞克隆形成效率來對比干細(xì)胞關(guān)鍵因子陽性和陰性表達(dá)細(xì)胞增殖情況，對比兩種細(xì)胞的成球能力，并進(jìn)行兩種細(xì)

4、胞裸鼠皮下移植成瘤率的對比。2通過miRNA芯片分別檢測干細(xì)胞關(guān)鍵因子陽性和陰性表達(dá)細(xì)胞中的miRNA變化并對比分析，篩選潛在與干細(xì)胞關(guān)鍵因子表達(dá)相關(guān)的miRNA，RealtimeRTPCR分別檢測胰腺癌組織標(biāo)本和細(xì)胞株中的相關(guān)miRNA表達(dá)，通過擴(kuò)增目的基因片段，及預(yù)測作用位點(diǎn)突變類型，分別構(gòu)建入pGL4這個含有熒光素酶(Luciferase)的質(zhì)粒形成載體，和miRNA共轉(zhuǎn)染于人正常胰腺上皮細(xì)胞株HPDE6c7中，熒光素酶活性雙報(bào)告