青魚nanog和oct4基因的鑒定及青鳉肌肉細(xì)胞系的建立.pdf

1、作為“四大家魚”之首，青魚（Mylopharyngodon piceus）是我國主要的養(yǎng)殖品種之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研意義。目前，有關(guān)青魚的研究主要集中在人工養(yǎng)殖、營養(yǎng)與飼料和疾病防控等方向而缺乏分子水平上的一些基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS)是一類具有無限自我更新能力且能在特定條件下定向分化的細(xì)胞，Nanog和Oct4基因是哺乳動(dòng)物中維持胚胎干細(xì)胞多能性以及自我更新能力的關(guān)鍵性基因，也是成功誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的關(guān)鍵因子。為

2、了成功誘導(dǎo)魚類iPS，本研究分離和鑒定了青魚nanog和oct4基因及nanog上游啟動(dòng)子序列，初步分析了它們的基因結(jié)構(gòu)、在不同成體組織和早期胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式，證明了它們的表達(dá)模式有別于哺乳動(dòng)物，具有母源性表達(dá)特征。此外，本研究還建立了青鳉肌肉細(xì)胞系(OLM)，分析和鑒定了它的基本生物學(xué)特征，并且通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)測定了不同區(qū)段nanog啟動(dòng)子在OLM中的活性。其主要研究結(jié)果如下:
　　1)Mpnanog基因組DNA(genom

3、ic DNA，gDNA)全長3295bp，cDNA全長1550bp，包括4個(gè)外顯子，預(yù)計(jì)編碼具有390個(gè)氨基酸殘基的蛋白;多物種蛋白序列比對結(jié)果顯示MpNanog具有一個(gè)Nanog蛋白保守的含有63個(gè)氨基酸殘基的同源結(jié)構(gòu)域，其中，MpNanog與團(tuán)頭魴Nanog蛋白相似程度最高，可達(dá)到95％;進(jìn)化樹結(jié)果顯示MpNanog與硬骨魚類聚為同一分支。
　　2)RT-PCR結(jié)果顯示Mpnanog特異性表達(dá)于卵巢中以及早期胚胎發(fā)育過程，從未

4、受精卵到囊胚期一直持續(xù)高表達(dá)，原腸胚期表達(dá)迅速下降;切片原位雜交結(jié)果進(jìn)一步顯示Mpnanog的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)于卵子發(fā)育過程中的卵原細(xì)胞（Ⅰ期）和初級卵母細(xì)胞(Ⅱ期);同時(shí)，整胚原位雜交結(jié)果顯示Mpnanog轉(zhuǎn)錄本的信號(hào)均勻的分布在早期胚胎發(fā)育的卵裂球中。
　　3)通過TAIL-PCR技術(shù)克隆得到了長約1.8kb的Mpnanog上游5'轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，構(gòu)建了Mpnanog不同區(qū)段啟動(dòng)子的雙色熒光質(zhì)粒psi-CHECK-2-Mpnanog-

5、1775、1070、550，并檢測了它在2種轉(zhuǎn)基因青鳉肌肉細(xì)胞系中均具有較高的活性。
　　4)Mpoct4cDNA全長共3412bp，預(yù)測編碼472個(gè)氨基酸;多物種蛋白序列比對顯示MpOct4同樣具有OCT4蛋白保守的POUs和POUHD亞結(jié)構(gòu)域，與已報(bào)道的團(tuán)頭魴Oct4相似度最高，約為98.31％;進(jìn)化樹結(jié)果顯示MpOct4與硬骨魚類聚為同一分支。
　　5)RT-PCR結(jié)果顯示Mpoct4特異性表達(dá)于卵巢中以及早期胚胎發(fā)育

6、過程，從未受精卵到原腸胚期一直持續(xù)高表達(dá)，胚胎后期表達(dá)量銳減;切片原位雜交結(jié)果進(jìn)一步顯示Mpoct4轉(zhuǎn)錄本表達(dá)于卵子發(fā)育過程中的卵原細(xì)胞（Ⅰ期）和初級卵母細(xì)胞（Ⅱ期）;同時(shí)，整胚原位雜交結(jié)果顯示Mpoct4轉(zhuǎn)錄本的信號(hào)分布于早期胚胎發(fā)育的卵裂球中。
　　6)建立了青鳉肌肉細(xì)胞系，并對其凍存復(fù)蘇能力、生長曲線、細(xì)胞來源和染色體核型等基本生物學(xué)特性進(jìn)行了描述，然后對該細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了測定。一系列結(jié)果顯示，OLM細(xì)胞系確實(shí)來源