青魚nanog和oct4基因的鑒定及青鳉肌肉細胞系的建立.pdf

1、作為“四大家魚”之首，青魚（Mylopharyngodon piceus）是我國主要的養(yǎng)殖品種之一，具有重要的經(jīng)濟價值和科研意義。目前，有關青魚的研究主要集中在人工養(yǎng)殖、營養(yǎng)與飼料和疾病防控等方向而缺乏分子水平上的一些基礎研究數(shù)據(jù)。誘導多功能干細胞(iPS)是一類具有無限自我更新能力且能在特定條件下定向分化的細胞，Nanog和Oct4基因是哺乳動物中維持胚胎干細胞多能性以及自我更新能力的關鍵性基因，也是成功誘導多功能干細胞的關鍵因子。為

2、了成功誘導魚類iPS，本研究分離和鑒定了青魚nanog和oct4基因及nanog上游啟動子序列，初步分析了它們的基因結構、在不同成體組織和早期胚胎發(fā)育中的表達模式，證明了它們的表達模式有別于哺乳動物，具有母源性表達特征。此外，本研究還建立了青鳉肌肉細胞系(OLM)，分析和鑒定了它的基本生物學特征，并且通過熒光素酶實驗測定了不同區(qū)段nanog啟動子在OLM中的活性。其主要研究結果如下:
　　1)Mpnanog基因組DNA(genom

3、ic DNA，gDNA)全長3295bp，cDNA全長1550bp，包括4個外顯子，預計編碼具有390個氨基酸殘基的蛋白;多物種蛋白序列比對結果顯示MpNanog具有一個Nanog蛋白保守的含有63個氨基酸殘基的同源結構域，其中，MpNanog與團頭魴Nanog蛋白相似程度最高，可達到95％;進化樹結果顯示MpNanog與硬骨魚類聚為同一分支。
　　2)RT-PCR結果顯示Mpnanog特異性表達于卵巢中以及早期胚胎發(fā)育過程，從未

4、受精卵到囊胚期一直持續(xù)高表達，原腸胚期表達迅速下降;切片原位雜交結果進一步顯示Mpnanog的轉(zhuǎn)錄本表達于卵子發(fā)育過程中的卵原細胞（Ⅰ期）和初級卵母細胞(Ⅱ期);同時，整胚原位雜交結果顯示Mpnanog轉(zhuǎn)錄本的信號均勻的分布在早期胚胎發(fā)育的卵裂球中。
　　3)通過TAIL-PCR技術克隆得到了長約1.8kb的Mpnanog上游5'轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，構建了Mpnanog不同區(qū)段啟動子的雙色熒光質(zhì)粒psi-CHECK-2-Mpnanog-

5、1775、1070、550，并檢測了它在2種轉(zhuǎn)基因青鳉肌肉細胞系中均具有較高的活性。
　　4)Mpoct4cDNA全長共3412bp，預測編碼472個氨基酸;多物種蛋白序列比對顯示MpOct4同樣具有OCT4蛋白保守的POUs和POUHD亞結構域，與已報道的團頭魴Oct4相似度最高，約為98.31％;進化樹結果顯示MpOct4與硬骨魚類聚為同一分支。
　　5)RT-PCR結果顯示Mpoct4特異性表達于卵巢中以及早期胚胎發(fā)育

6、過程，從未受精卵到原腸胚期一直持續(xù)高表達，胚胎后期表達量銳減;切片原位雜交結果進一步顯示Mpoct4轉(zhuǎn)錄本表達于卵子發(fā)育過程中的卵原細胞（Ⅰ期）和初級卵母細胞（Ⅱ期）;同時，整胚原位雜交結果顯示Mpoct4轉(zhuǎn)錄本的信號分布于早期胚胎發(fā)育的卵裂球中。
　　6)建立了青鳉肌肉細胞系，并對其凍存復蘇能力、生長曲線、細胞來源和染色體核型等基本生物學特性進行了描述，然后對該細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率進行了測定。一系列結果顯示，OLM細胞系確實來源