新型非病毒基因給藥載體聚陽離子脂質體的研究.pdf

1、基因治療為遺傳性疾病，傳染病和癌癥等的治療提供了良好的前景，而研制安全有效的基因傳遞系統(tǒng)將成為基因治療成功的最重要因素之一。本課題結合陽離子聚合物和脂質體兩種常用的非病毒基因載體的優(yōu)點，構建了一種新型的聚陽離子脂質體，對其性質、細胞毒性、攝取和體外轉染效率進行了探討，并研究了該載體的細胞攝取機制，細胞攝取動力學、胞內分布以及攜載端粒酶抑制劑后的體外細胞藥效學。本課題在此研究基礎上構建聚陽離子脂質體-魚精蛋白-DNA復合載體，研究了魚精蛋

2、白對聚陽離子脂質體轉染的促進作用和細胞核的靶向作用。最后考察了聚陽離子脂質體和復合載體介導的IL-12質粒對荷瘤小鼠的抑瘤作用。 本課題首先采用低分子量聚乙烯亞胺和酰氯膽固醇合成了PEI800-Chol，經(jīng)1H-NMR和紅外光譜鑒定，膽固醇分子共價結合到聚乙烯亞胺骨架上。PEI800-Chol分子具有兩親性，親水端為聚乙烯亞胺骨架，親脂端是膽固醇分子，熒光探針法測得該化合物的臨界膠團濃度為0．1012 mg/ml。這一性質為下一

3、步的脂質體表面修飾提供了有利條件，膽固醇分子能夠插入到脂質體雙分子層，使得陽離子的聚乙烯亞胺覆蓋于脂質體表面，從而使脂質體帶正電荷。 本課題以大豆磷脂、膽固醇和PEI800-Chol或DOPE和PEI800-Chol為脂質膜材，采用薄膜分散法制備了兩種聚陽離子脂質體（PCLs-S和PCLs-D）。聚陽離子脂質體的平均粒徑為133 nm，表面電荷50．1±2．6 mV，具有較強的DNA壓縮能力。兩種聚陽離子脂質體在N/P大于2時都

4、能結合大部分DNA，而PCLs-S的結合能力大于PCLs-D。PCLs-S的細胞毒性與普通脂質體相當，HeLa細胞的IC50為603．19μg/ml，細胞毒性明顯小于商品化試劑LipofectamineTM2000（48μ/ml）。PCLs-S表面的正電荷能夠促進HeLa細胞對ODN的攝取，并保護其在細胞內不被降解。與普通脂質體相比，由于表面PEI分子的存在，使得PCLs-S保持了一定的緩沖能力，大大增加了脂質體的內體逃逸能力，有助于提

5、高轉染效率。當N/P為10時，PCLs-S/DNA復合物的轉染效率最高，與LipofectamineTM2000轉染能力相當。與LipofectamineTM2000不同的是在血清存在條件下，PCLs-S的轉染效率不受影響，而更高N/P比時，血清的存在增加了綠色熒光蛋白的表達。親水性的PEI層可能有助于保持復合物在血清中的穩(wěn)定性，提高轉染效率。利用DOPE和PEI800-Chol制備的PCLs-D具有膜融合及“質子泵”緩沖的雙重內體逃逸

6、能力，該聚陽離子脂質體介導的綠色熒光蛋白表達率高達68％，顯著高于PCLs-S和LipofectamineTM2000（～44％）。 本課題初步研究了聚陽離子脂質體的細胞攝取機制、細胞內的分布和細胞攝取動力學。細胞攝取聚陽離子脂質體的能力和途徑與最終的轉染效率有一定的聯(lián)系，而不同細胞株的攝取機制也存在差異。內吞抑制劑氯丙嗪（特異性抑制網(wǎng)格蛋白介導的內吞）作用A549細胞后，能夠抑制聚陽離子脂質體的攝取和轉染（大于97％），激光掃

7、描共聚焦顯微鏡觀察，F(xiàn)AM標記的ODN集中于細胞周圍，PCLs-D/ODN復合物尤為明顯，說明A549細胞攝取聚陽離子脂質體以網(wǎng)格蛋白介導的內吞途徑占主導。MCF-7細胞的攝取方式相對復雜，除了非網(wǎng)格蛋白介導的內吞途徑外還存在一些非能量依賴的內化方式。細胞攝取動力學研究表明，A549細胞對游離ODN、PCLs-S/ODN復合物和PCLs-D/ODN復合物的攝取在4h后趨于穩(wěn)態(tài)，PCLs-S和PCLs-D能夠分別提高ODN的細胞攝取速度2

8、．20倍和5．45倍，此外PCLs-D還能降低細胞對ODN的消除，增加ODN在胞內的滯留時間。 基于聚陽離子脂質體理化性質和轉染能力的研究，本課題以hTERT為靶點的ASODN為治療基因，比較了傳統(tǒng)陽離子脂質體與聚陽離子脂質體的體外細胞藥效學。CLs能夠顯著增加ASODN的腫瘤細胞抑制作用，ASODN經(jīng)CLs介導后IC50從153．9μmol/L下降至1．28μmol/L。CLs還能提高ASODN在胞內的穩(wěn)定性，實現(xiàn)了一次給藥后

9、120 h內持續(xù)抑制腫瘤細胞的生長。PCLs同樣能夠提高ASODN的細胞抑制作用，而且細胞毒性更小，更有利于體內給藥研究。 質粒DNA進入細胞核是限制基因轉染的關鍵步驟之一，在成功解決載體內體逃逸之后，本課題又對PCLs-D進行了修飾，通過加入魚精蛋白增加DNA的入核能力，構建聚陽離子脂質體-魚精蛋白-DNA復合載體。采用“Pre-mixed”和“Post-mixed”兩種方法制備的復合載體均顯著提高了質粒DNA的轉染效率，分別

10、是PCLs-D/DNA復合物轉染能力的85倍和12倍，而魚精蛋白-DNA納米粒沒有轉染能力；其他無細胞核靶向能力的陽離子聚合物如殼聚糖和PEI25k經(jīng)同樣方法制備得到的復合載體沒有表現(xiàn)出與魚精蛋白相同的效果，說明魚精蛋白的細胞核靶向能力對復合載體的轉染起了很大的作用，而這一促進作用需要內體逃逸能力為前提條件，激光掃描共聚焦顯微術也驗證了復合載體傳遞的基因在細胞內的核靶向能力。魚精蛋白不僅能增加質粒DNA進入細胞核的數(shù)量，經(jīng)超聲破壞實驗顯

11、示，魚精蛋白與DNA形成的納米結構能夠很好地保護質粒DNA的完整性，使質粒DNA在細胞內具有長時間轉染能力，細胞轉染72h后仍有較高水平的基因表達。 經(jīng)過一系列的體外研究，本課題最后選用IL-12質粒為治療基因，考察了PCLs-D及其復合載體瘤內直接注射后對荷瘤小鼠的抑瘤效果。結果發(fā)現(xiàn)，實驗濃度裸IL-12質粒沒有抗腫瘤效果，且外周血清中IFN-γ水平較低。經(jīng)兩種載體介導后，均表現(xiàn)出對腫瘤生長的抑制作用，IFN-γ水平也進一步提