新型非病毒基因給藥載體聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體的研究.pdf

1、基因治療為遺傳性疾病，傳染病和癌癥等的治療提供了良好的前景，而研制安全有效的基因傳遞系統(tǒng)將成為基因治療成功的最重要因素之一。本課題結(jié)合陽(yáng)離子聚合物和脂質(zhì)體兩種常用的非病毒基因載體的優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建了一種新型的聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體，對(duì)其性質(zhì)、細(xì)胞毒性、攝取和體外轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了探討，并研究了該載體的細(xì)胞攝取機(jī)制，細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)、胞內(nèi)分布以及攜載端粒酶抑制劑后的體外細(xì)胞藥效學(xué)。本課題在此研究基礎(chǔ)上構(gòu)建聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體-魚(yú)精蛋白-DNA復(fù)合載體，研究了魚(yú)精蛋

2、白對(duì)聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的促進(jìn)作用和細(xì)胞核的靶向作用。最后考察了聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體和復(fù)合載體介導(dǎo)的IL-12質(zhì)粒對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤作用。 本課題首先采用低分子量聚乙烯亞胺和酰氯膽固醇合成了PEI800-Chol，經(jīng)1H-NMR和紅外光譜鑒定，膽固醇分子共價(jià)結(jié)合到聚乙烯亞胺骨架上。PEI800-Chol分子具有兩親性，親水端為聚乙烯亞胺骨架，親脂端是膽固醇分子，熒光探針?lè)y(cè)得該化合物的臨界膠團(tuán)濃度為0．1012 mg/ml。這一性質(zhì)為下一

3、步的脂質(zhì)體表面修飾提供了有利條件，膽固醇分子能夠插入到脂質(zhì)體雙分子層，使得陽(yáng)離子的聚乙烯亞胺覆蓋于脂質(zhì)體表面，從而使脂質(zhì)體帶正電荷。 本課題以大豆磷脂、膽固醇和PEI800-Chol或DOPE和PEI800-Chol為脂質(zhì)膜材，采用薄膜分散法制備了兩種聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體（PCLs-S和PCLs-D）。聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體的平均粒徑為133 nm，表面電荷50．1±2．6 mV，具有較強(qiáng)的DNA壓縮能力。兩種聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體在N/P大于2時(shí)都

4、能結(jié)合大部分DNA，而PCLs-S的結(jié)合能力大于PCLs-D。PCLs-S的細(xì)胞毒性與普通脂質(zhì)體相當(dāng)，HeLa細(xì)胞的IC50為603．19μg/ml，細(xì)胞毒性明顯小于商品化試劑LipofectamineTM2000（48μ/ml）。PCLs-S表面的正電荷能夠促進(jìn)HeLa細(xì)胞對(duì)ODN的攝取，并保護(hù)其在細(xì)胞內(nèi)不被降解。與普通脂質(zhì)體相比，由于表面PEI分子的存在，使得PCLs-S保持了一定的緩沖能力，大大增加了脂質(zhì)體的內(nèi)體逃逸能力，有助于提

5、高轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)N/P為10時(shí)，PCLs-S/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率最高，與LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染能力相當(dāng)。與LipofectamineTM2000不同的是在血清存在條件下，PCLs-S的轉(zhuǎn)染效率不受影響，而更高N/P比時(shí)，血清的存在增加了綠色熒光蛋白的表達(dá)。親水性的PEI層可能有助于保持復(fù)合物在血清中的穩(wěn)定性，提高轉(zhuǎn)染效率。利用DOPE和PEI800-Chol制備的PCLs-D具有膜融合及“質(zhì)子泵”緩沖的雙重內(nèi)體逃逸

6、能力，該聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白表達(dá)率高達(dá)68％，顯著高于PCLs-S和LipofectamineTM2000（～44％）。 本課題初步研究了聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取機(jī)制、細(xì)胞內(nèi)的分布和細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)。細(xì)胞攝取聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體的能力和途徑與最終的轉(zhuǎn)染效率有一定的聯(lián)系，而不同細(xì)胞株的攝取機(jī)制也存在差異。內(nèi)吞抑制劑氯丙嗪（特異性抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞）作用A549細(xì)胞后，能夠抑制聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體的攝取和轉(zhuǎn)染（大于97％），激光掃

7、描共聚焦顯微鏡觀察，F(xiàn)AM標(biāo)記的ODN集中于細(xì)胞周?chē)琍CLs-D/ODN復(fù)合物尤為明顯，說(shuō)明A549細(xì)胞攝取聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑占主導(dǎo)。MCF-7細(xì)胞的攝取方式相對(duì)復(fù)雜，除了非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑外還存在一些非能量依賴(lài)的內(nèi)化方式。細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)研究表明，A549細(xì)胞對(duì)游離ODN、PCLs-S/ODN復(fù)合物和PCLs-D/ODN復(fù)合物的攝取在4h后趨于穩(wěn)態(tài)，PCLs-S和PCLs-D能夠分別提高ODN的細(xì)胞攝取速度2

8、．20倍和5．45倍，此外PCLs-D還能降低細(xì)胞對(duì)ODN的消除，增加ODN在胞內(nèi)的滯留時(shí)間。 基于聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體理化性質(zhì)和轉(zhuǎn)染能力的研究，本課題以hTERT為靶點(diǎn)的ASODN為治療基因，比較了傳統(tǒng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體與聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體的體外細(xì)胞藥效學(xué)。CLs能夠顯著增加ASODN的腫瘤細(xì)胞抑制作用，ASODN經(jīng)CLs介導(dǎo)后IC50從153．9μmol/L下降至1．28μmol/L。CLs還能提高ASODN在胞內(nèi)的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了一次給藥后

9、120 h內(nèi)持續(xù)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。PCLs同樣能夠提高ASODN的細(xì)胞抑制作用，而且細(xì)胞毒性更小，更有利于體內(nèi)給藥研究。 質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞核是限制基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵步驟之一，在成功解決載體內(nèi)體逃逸之后，本課題又對(duì)PCLs-D進(jìn)行了修飾，通過(guò)加入魚(yú)精蛋白增加DNA的入核能力，構(gòu)建聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體-魚(yú)精蛋白-DNA復(fù)合載體。采用“Pre-mixed”和“Post-mixed”兩種方法制備的復(fù)合載體均顯著提高了質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率，分別

10、是PCLs-D/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染能力的85倍和12倍，而魚(yú)精蛋白-DNA納米粒沒(méi)有轉(zhuǎn)染能力；其他無(wú)細(xì)胞核靶向能力的陽(yáng)離子聚合物如殼聚糖和PEI25k經(jīng)同樣方法制備得到的復(fù)合載體沒(méi)有表現(xiàn)出與魚(yú)精蛋白相同的效果，說(shuō)明魚(yú)精蛋白的細(xì)胞核靶向能力對(duì)復(fù)合載體的轉(zhuǎn)染起了很大的作用，而這一促進(jìn)作用需要內(nèi)體逃逸能力為前提條件，激光掃描共聚焦顯微術(shù)也驗(yàn)證了復(fù)合載體傳遞的基因在細(xì)胞內(nèi)的核靶向能力。魚(yú)精蛋白不僅能增加質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞核的數(shù)量，經(jīng)超聲破壞實(shí)驗(yàn)顯

11、示，魚(yú)精蛋白與DNA形成的納米結(jié)構(gòu)能夠很好地保護(hù)質(zhì)粒DNA的完整性，使質(zhì)粒DNA在細(xì)胞內(nèi)具有長(zhǎng)時(shí)間轉(zhuǎn)染能力，細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后仍有較高水平的基因表達(dá)。 經(jīng)過(guò)一系列的體外研究，本課題最后選用IL-12質(zhì)粒為治療基因，考察了PCLs-D及其復(fù)合載體瘤內(nèi)直接注射后對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)濃度裸IL-12質(zhì)粒沒(méi)有抗腫瘤效果，且外周血清中IFN-γ水平較低。經(jīng)兩種載體介導(dǎo)后，均表現(xiàn)出對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，IFN-γ水平也進(jìn)一步提