陽離子聚磷腈衍生物的合成與修飾及其作為基因非病毒載體的研究.pdf

1、為了對新型陽離子聚磷腈基因非病毒載體作出初步評價，分別進行了叔胺類和伯胺類兩種陽離子聚磷腈衍生物的合成，并進一步對伯胺類聚磷腈進行了咪唑丙烯酸和半乳糖的修飾，以達到增加聚合物的溶酶體逃逸能力和主動靶向能力的目的。在對合成的聚磷腈衍生物進行結構表征之后，對聚合物與DNA自組裝納米粒進行了體外特性和體外轉染的研究，并且對半乳糖修飾聚磷腈與DNA自組裝納米粒在人肝癌細胞BEL-7402皮下移植瘤小鼠的體內轉染也進行了初步研究。
　　

2、叔胺類聚磷腈衍生物的合成包括聚DMAEA/Boc-組氨酸甲酯磷腈(PDHP)和不同咪唑取代度的聚咪唑/DMAEA磷腈(PIDP)。Boc-組氨酸甲酯取代比例為13％的PDHP和咪唑取代度為17％的PIDP1在與DNA比例為10:1(重量比)時均自組裝形成100 nm左右并帶有一定正電荷的納米粒，該納米粒在無血清轉染介質的293T細胞中均有較高的體外轉染效率，比相同條件下PEI/DNA納米粒的轉染效率分別高出1倍和2倍，也遠遠高出DMAE

3、A全取代的PDAP/DNA納米粒的轉染效率，且細胞毒性遠遠低于對照組PEI/DNA自組裝納米粒。
　　 伯胺類聚2-甘醇胺磷腈(PAEP)/DNA自組裝納米粒在有血清轉染介質中能有效轉染且細胞毒性遠遠小于對照組PEI/DNA自組裝納米粒。對PAEP進行咪唑丙烯酸的修飾合成得到取代度分別為7％和25％的兩種衍生物，隨著咪唑丙烯酸的取代度的增加，其正電荷量隨之降低，細胞毒性也相應降低，緩沖能力比未取代的PAEP有所增加，細胞攝取水平

4、有所提高，轉染效率也有不同表現(xiàn)。其中咪唑丙烯酸取代度為7％的UA7-PAEP/DNA自組裝納米粒比取代度25％的UA25-PAEP/DNA自組裝納米粒以及未取代的PAEP/DNA自組裝納米粒在Hela細胞和COS7細胞相同轉染條件下的轉染效率均明顯提高。
　　 PAEP/DNA、UA7-PAEP/DNA和UA25-PAEP/DNA自組裝納米粒在Hela.細胞和COS7兩種細胞中的轉染效率均受到質子泵抑制劑的抑制，說明三種納米粒的

5、轉染效率均與溶酶體酸化過程密切相關。考察了水和pH5.7醋酸鹽緩沖液兩種制備介質對納米粒轉染效率的影響后發(fā)現(xiàn)，在pH5.7醋酸鹽緩沖液中制備的UA7-PAEP和UA25-PAEP/DNA自組裝納米粒的轉染效率比在水中制備的納米粒的轉染效率有明顯的提高，尤其是咪唑丙烯酸取代程度較高的UA25-PAE，而對PAEP/DNA自組裝納米粒的轉染效率影響不大，總之，將PAEP聚合物進行7％咪唑丙烯酸的取代之后，不僅體外傳染效率最高，而且明顯降低了

6、該聚合物的細胞毒性。
　　 為了進一步提高伯胺類聚磷腈PAEP對肝癌細胞的主動靶向性，本課題合成了5％半乳糖取代的LA-PAEP，在與DNA比例為20:1時自組裝形成粒徑在130 nm左右的納米粒。該LA-PAEP/DNA納米粒的細胞毒性比PAEP/DNA納米粒和PEI/DNA納米粒對照組明顯降低，其在BEL-7402人肝癌細胞中的攝取以及熒光素酶的表達都明顯高于Hela細胞，在BEL-7402人肝癌細胞中的轉染效率也高于PAE

7、P/DNA納米粒。競爭性拮抗實驗表明，在游離半乳糖的存在下，LA-PAEP/DNA納米粒在BEL-7402人肝癌細胞中的轉染效率明顯降低，表明該納米粒為受體介導途徑入胞。在體內轉染實驗中，LA-PAEP/DNA納米粒在人肝癌細胞BEL-7402移植瘤小鼠腫瘤組織的表達高出PAEP/DNA納米粒2倍，PEI/DNA納米粒在腫瘤組織的表達量最高。以上實驗表明，LA-PAEP/DNA納米粒在體內表現(xiàn)出BEL-7402腫瘤組織的靶向性。此結果與