殼聚糖衍生物非病毒基因載體的研究.pdf

1、殼聚糖是一種天然的陽(yáng)離子多糖，具有良好的生物相容性，生物降解性，低免疫原性以及無毒性的優(yōu)點(diǎn)。殼聚糖通過靜電作用可以與DNA形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，保護(hù)DNA免受核酸酶的降解，從而促使DNA順利的進(jìn)入細(xì)胞，因此殼聚糖作為非病毒基因載體具有廣泛的應(yīng)用前景。本文制備了兩種新型的殼聚糖非病毒載體，精氨酸修飾的殼聚糖（Arg-CS）和N-亞甲基磷酸化殼聚糖（NMPCS），探討其物理化學(xué)性質(zhì)及其與DNA之間的相互作用及基因轉(zhuǎn)染行為，對(duì)殼聚糖載基因納米粒

2、子熒光標(biāo)記條件進(jìn)行了優(yōu)化，探討了精氨酸修飾殼聚糖載基因血管支架體內(nèi)局部釋放基因的可行性。本研究主要包括以下幾個(gè)方面： ⑴精氨酸修飾的殼聚糖的制備及其與DNA相互作用的研究。通過紅外光譜和核磁共振圖譜分析，可以確認(rèn)精氨酸已經(jīng)共價(jià)連接到殼聚糖上。圓二色譜結(jié)果表明DNA與殼聚糖作用形成納米尺寸的復(fù)合物后仍然保持著典型的B型構(gòu)象。用透射電鏡，原子力顯微鏡和光子相關(guān)光譜檢測(cè)復(fù)合物的表面形態(tài)和尺寸大小分布，結(jié)果表明，精氨酸修飾的殼聚糖/DN

3、A納米復(fù)合物（N/P=2：1）呈現(xiàn)不規(guī)則的球形，復(fù)合物的直徑分布大多在80～150nm之間，有利于基因轉(zhuǎn)染。 ⑵精氨酸修飾的殼聚糖介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染研究。精氨酸修飾的殼聚糖介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒的表達(dá)較未修飾的殼聚糖介導(dǎo)的熒光素酶質(zhì)粒的表達(dá)提高了大約100倍，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，精氨酸修飾的殼聚糖及其與DNA的復(fù)合物對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性非常小。 ⑶N-亞甲基磷酸化殼聚糖的制備及其與DNA相互作用的研究。以紅外光譜（FTIR）分析

4、表明改性后的殼聚糖的特征基團(tuán)有顯著變化；13C NMR檢測(cè)進(jìn)一步證明了亞甲基磷酸基團(tuán)的引入。通過復(fù)凝聚的方法，制備了納米尺寸的NMPCS/DNA聚電解質(zhì)復(fù)合物?？疾炝斯簿畚锱cDNA的相互作用情況，復(fù)合物中DNA的構(gòu)象變化和復(fù)合物的形態(tài)和粒徑。圓二色譜結(jié)果表明DNA與殼聚糖作用形成納米尺寸的復(fù)合物后仍然保持著典型的B型構(gòu)象。透射電鏡，原子力顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明，不同N/P下的N-亞甲基磷酸化修飾的殼聚糖/DNA納米復(fù)合物呈現(xiàn)較規(guī)則的球形，且

5、在高電荷比時(shí)可形成尺寸較小的納米尺度顆粒。 ⑷以人宮頸癌細(xì)胞HeLa為宿主細(xì)胞，嘗試了以NMPCS為載體介導(dǎo)含熒光素酶的pGL3質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染，重點(diǎn)研究了pH值和N/P比對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，載體可有效將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，獲得的最佳轉(zhuǎn)染效率運(yùn)高于裸DNA和CS，與PEI相當(dāng)?；诹姿峄鶊F(tuán)對(duì)鈣離子有良好的鰲合能力制備了聚合物鹽型NMPCS-Ca載體，并用于介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染過程類似于傳統(tǒng)的P-Ca載體，并認(rèn)為Ca2

6、+離子通道促進(jìn)了轉(zhuǎn)染過程。 ⑸殼聚糖載基因納米粒子熒光標(biāo)記的優(yōu)化研究?？疾炝薋ITC與殼聚糖反應(yīng)的主要影響因素，觀察了熒光標(biāo)記對(duì)納米粒子表征和轉(zhuǎn)染效率的影響，建立一種快速、穩(wěn)定并且適宜殼聚糖納米載體示蹤的熒光標(biāo)記方法。殼聚糖納米粒子表征和轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)顯示最佳的殼聚糖標(biāo)記條件是反應(yīng)物殼聚糖與FITC的添加比例為25：1，在pH值7.5室溫25℃反應(yīng)4小時(shí)。 ⑹精氨酸修飾殼聚糖載基因支架血管內(nèi)基因轉(zhuǎn)運(yùn)的研究。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示