殼聚糖衍生物非病毒基因載體的研究.pdf

1、殼聚糖是一種天然的陽離子多糖，具有良好的生物相容性，生物降解性，低免疫原性以及無毒性的優(yōu)點。殼聚糖通過靜電作用可以與DNA形成聚電解質復合物，保護DNA免受核酸酶的降解，從而促使DNA順利的進入細胞，因此殼聚糖作為非病毒基因載體具有廣泛的應用前景。本文制備了兩種新型的殼聚糖非病毒載體，精氨酸修飾的殼聚糖（Arg-CS）和N-亞甲基磷酸化殼聚糖（NMPCS），探討其物理化學性質及其與DNA之間的相互作用及基因轉染行為，對殼聚糖載基因納米粒

2、子熒光標記條件進行了優(yōu)化，探討了精氨酸修飾殼聚糖載基因血管支架體內局部釋放基因的可行性。本研究主要包括以下幾個方面： ⑴精氨酸修飾的殼聚糖的制備及其與DNA相互作用的研究。通過紅外光譜和核磁共振圖譜分析，可以確認精氨酸已經共價連接到殼聚糖上。圓二色譜結果表明DNA與殼聚糖作用形成納米尺寸的復合物后仍然保持著典型的B型構象。用透射電鏡，原子力顯微鏡和光子相關光譜檢測復合物的表面形態(tài)和尺寸大小分布，結果表明，精氨酸修飾的殼聚糖/DN

3、A納米復合物（N/P=2：1）呈現(xiàn)不規(guī)則的球形，復合物的直徑分布大多在80～150nm之間，有利于基因轉染。 ⑵精氨酸修飾的殼聚糖介導的基因轉染研究。精氨酸修飾的殼聚糖介導熒光素酶質粒的表達較未修飾的殼聚糖介導的熒光素酶質粒的表達提高了大約100倍，在整個實驗濃度范圍內，精氨酸修飾的殼聚糖及其與DNA的復合物對HeLa細胞的毒性非常小。 ⑶N-亞甲基磷酸化殼聚糖的制備及其與DNA相互作用的研究。以紅外光譜（FTIR）分析

4、表明改性后的殼聚糖的特征基團有顯著變化；13C NMR檢測進一步證明了亞甲基磷酸基團的引入。通過復凝聚的方法，制備了納米尺寸的NMPCS/DNA聚電解質復合物?？疾炝斯簿畚锱cDNA的相互作用情況，復合物中DNA的構象變化和復合物的形態(tài)和粒徑。圓二色譜結果表明DNA與殼聚糖作用形成納米尺寸的復合物后仍然保持著典型的B型構象。透射電鏡，原子力顯微鏡檢測結果表明，不同N/P下的N-亞甲基磷酸化修飾的殼聚糖/DNA納米復合物呈現(xiàn)較規(guī)則的球形，且

5、在高電荷比時可形成尺寸較小的納米尺度顆粒。 ⑷以人宮頸癌細胞HeLa為宿主細胞，嘗試了以NMPCS為載體介導含熒光素酶的pGL3質粒的體外轉染，重點研究了pH值和N/P比對轉染效率的影響。實驗結果表明，載體可有效將質粒轉染HeLa細胞，獲得的最佳轉染效率運高于裸DNA和CS，與PEI相當。基于磷酸基團對鈣離子有良好的鰲合能力制備了聚合物鹽型NMPCS-Ca載體，并用于介導基因轉染，其轉染過程類似于傳統(tǒng)的P-Ca載體，并認為Ca2

6、+離子通道促進了轉染過程。 ⑸殼聚糖載基因納米粒子熒光標記的優(yōu)化研究?？疾炝薋ITC與殼聚糖反應的主要影響因素，觀察了熒光標記對納米粒子表征和轉染效率的影響，建立一種快速、穩(wěn)定并且適宜殼聚糖納米載體示蹤的熒光標記方法。殼聚糖納米粒子表征和轉染效率實驗顯示最佳的殼聚糖標記條件是反應物殼聚糖與FITC的添加比例為25：1，在pH值7.5室溫25℃反應4小時。 ⑹精氨酸修飾殼聚糖載基因支架血管內基因轉運的研究。細胞轉染實驗顯示