MCPH1 shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及其穩(wěn)定表達(dá)的宮頸癌CaSki細(xì)胞系的建立.pdf

1、子宮頸癌（cervical cancer，CC）是女性常見的惡性腫瘤之一，居我國女性腫瘤第一位，每年新發(fā)現(xiàn)的病例為13.15萬，近年來年輕婦女患宮頸癌的越來越多，已由20世紀(jì)50年代的9％上升到現(xiàn)在的24％。所以關(guān)于宮頸癌的研究越來越引起人們的重視。
　　 近年來，隨著人們對宮頸癌病因及分子機(jī)制等研究的深入，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，宮頸癌的治療有了一種新策略。研究者們提出可以將目的基因用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入靶細(xì)胞，在分子水平上阻斷宮頸

2、癌的發(fā)生發(fā)展。此方法具有治療特異性強(qiáng)、效果顯著、基本不損傷正常組織的優(yōu)點(diǎn)，是一項(xiàng)非常有前景的宮頸癌治療方案。
　　 本研究擬使用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的MCPH1 shRNA建立RNA干擾表達(dá)體系，并觀察其在宮頸癌CaSki細(xì)胞中對MCPH1表達(dá)的影響，為宮頸癌基因治療的深入研究奠定必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 1.MCPH1 siRNA有效序列的篩選。設(shè)計(jì)siRNA序列，人工化學(xué)合成后，用RNAiMax將其

3、轉(zhuǎn)入宮頸癌CaSki細(xì)胞中，①利用RT-PCR技術(shù)檢測處理后細(xì)胞中MCPH1 mRNA的表達(dá)情況。②使用Western-blotting技術(shù)檢測處理后細(xì)胞中MCPH1蛋白的表達(dá)情況。
　　 2.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及鑒定。根據(jù)篩選出的有效siRNA序列，設(shè)計(jì)并合成shRNA雙鏈DNA片段，將該片段重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pSUPER Retro中，進(jìn)行測序分析鑒定，構(gòu)建攜帶人MCPH1基因RNA干擾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPER-sh

4、RNA-MCPH1。
　　 3.穩(wěn)定表達(dá)的宮頸癌CaSki細(xì)胞系的建立。①用PT67細(xì)胞包裝構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。②使用產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染宮頸癌細(xì)胞珠CaSki細(xì)胞，用puromycin篩選產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。③用RT-PCR與real time PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中MCPH1 mRNA表達(dá)的變化。④用Western-Blotting技術(shù)檢測細(xì)胞中MCPH1蛋白表達(dá)的變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.設(shè)

5、計(jì)出兩條siRNA的序列，轉(zhuǎn)入細(xì)胞72h后提取總RNA和蛋白，經(jīng)RT-PCR及Western-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)MCPH1的表達(dá)均受到抑制。其中1號序列的干擾效果最為明顯。
　　 2.成功構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確。
　　 3.成功包裝出逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染CaSki細(xì)胞后用puromycm篩選出穩(wěn)定的單細(xì)胞克?。籖T-PCR，real time PCR和Western-Blotting檢測人MCPH1 mRNA和