針對XIAP基因shRNA表達載體的構(gòu)建及其對宮頸癌HeLa細胞的影響.pdf

1、目的：本實驗構(gòu)建針對人XIAP基因的小干擾RNA表達載體，并轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞系HeLa細胞，觀察其對XIAP mRNA表達及對Hela細胞凋亡和周期的影響。研究不僅為針對XIAP基因的RNA干擾提供新的有效的作用靶位，而且為體內(nèi)表達載體介導的RNA干擾作為一種有效的基因沉默技術(shù)的應用提供新的實驗依據(jù)，為針對凋亡抑制基因XIAP的宮頸癌基因治療提供新的途徑，同時也對RNA干擾技術(shù)在腫瘤研究和基因治療方面應用的可能性進行有益的探索。

2、 方法：研究對象為人宮頸癌HeLa細胞株。（1）構(gòu)建針對XIAP的表達載體pGPU6—GFP—XIAP—shRNA。（2）培養(yǎng)HeLa細胞通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進入細胞，并設置空白對照組（Blank）、轉(zhuǎn)染試劑組（mock）、陰性組（NC）、干擾組（pGPU6—GFP—XIAP—shRNA）組。（3）實時熒光定量PCR檢測各組XIAP mRNA的相對表達量。（4）同時應用流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡率和PI單染檢測細胞周期。 結(jié)果：（1）p

3、GPU6一GFP—XIAP—shRNA質(zhì)粒進行酶切鑒定，同時測序鑒定也證實目的序列已準確插入到預計位點，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。（2）實時熒光定量PCR結(jié)果顯示pGPU6—GFP—XIAP—shRNA轉(zhuǎn)染48h和72h后HeLa細胞中XIAP mRNA的表達量下降27%和51%，與空白組相比有差異（P<0．05）。而且在48h至72h期間，干擾片段沉默效應呈趨勢增強，XIAP基因mRNA的表達量呈遞減趨勢。（3）流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，在48h和

4、72h XIAP—shRNA組細胞凋亡率（31．60±1．29%和37．43±1．94%）與Blank對照組（1．58±1．34%和2．12±1．44%）、mock組（4．19±1．64%和4．87±1．50%）、NC組（4．58±1．63%和5．15±1．82%）相比細胞凋亡率顯著增加（P<0．05）。（4）PI單染流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果證實轉(zhuǎn)染XIAP—shRNA組的HeLa細胞周期發(fā)生改變，轉(zhuǎn)染后G0/G1期細胞顯著增加，與B

5、lank組相比出現(xiàn)G0/G1期阻滯現(xiàn)象，G0/G1期升高而S期下降（P<0．05）： 結(jié)論：（1）針對XIAP基因設計合成的shRNA干擾片段準確地克隆到pGPU6—GFP表達載體中，說明表達載體構(gòu)建成功。（2）應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑能高效地將重組載體轉(zhuǎn)染入HeLa細胞，從而保證了重組載體在細胞內(nèi)高效地表達。（3）針對XIAP基因shRNA的能夠在HeLa中成功發(fā)揮特異、有效的基因沉默作用?？擅黠@降低宮頸癌HeLa細胞XIAP基因m