未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)因子GRP78、ATF6和XPB1在食管鱗癌中的表達及其意義.pdf

1、背景與目的
　　食管癌(Esophagealcancinoma，EC)是常見的威脅人類生命健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。食管鱗狀細胞癌（Esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）是主要病變發(fā)生在食管鱗狀上皮組織的食管惡性腫瘤，在中國約95％以上的食管癌病例為食管鱗狀細胞癌。目前而言，食管癌發(fā)病率、死亡率均較高。全世界每年新發(fā)病例人數(shù)約為40萬例，每年約有30萬人死于該病;中國屬于食管癌高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率

2、約為13/10萬，死亡率約為15萬/年。研究表明，早期食管癌患者若能及時、有效診療，其治療后5年生存率可達到90％以上;由于食管癌的發(fā)生發(fā)展過程呈逐漸演變性，早期癥狀并不明顯，加之早期篩查診斷等方面的缺失，入院首診多為中晚期病例，治療后5年生存率低于10％。目前針對食管癌的治療主要以手術(shù)、放療、化療以及生物治療等傳統(tǒng)腫瘤治療方法為主，雖然近年來伴隨食管癌診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，患者的生存率和生活質(zhì)量都有相應(yīng)的提高，但總體治療效果仍不理想。

3、因而現(xiàn)階段食管癌的研究主要集中在如何早期發(fā)現(xiàn)食管癌、尋找更有效的治療方式、提升治愈率及提高患者治療后生存質(zhì)量。
　　食管鱗狀細胞癌作為實體惡性腫瘤之一，也存在多步驟和多基因突變的發(fā)生、發(fā)展過程，同樣也與腫瘤的生長代謝與生長分數(shù)、自身程序性死亡等因素均存在關(guān)聯(lián)。未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse，UPR)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress，ERS)其中重要的一種類型，其可

4、能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。
　　實體腫瘤細胞生長過程中因其失控性生長和增殖消耗大量的營養(yǎng)和氧氣，加之血供不足等原因，普遍存在著微環(huán)境缺氧、營養(yǎng)匱乏、PH改變等情況，在這種不良的環(huán)境影響下，可致組織細胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成錯誤折疊堆積，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的發(fā)生。未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)作為ERS中重要分支，是一種在進化上高度保守的細胞反應(yīng)機制，通過抑制蛋白翻譯，誘導(dǎo)ERS內(nèi)伴侶蛋白分子合成，

5、增強蛋白折疊能力，促進蛋白外輸和未折疊蛋白降解，以恢復(fù)ERS穩(wěn)態(tài)。這提升了腫瘤細胞生長過程中在有害因素下的生存能力，也可能是使腫瘤細胞惡性度提高并增加遷徙率的重要機制，同時持續(xù)或過度的UPR可導(dǎo)致腫瘤細胞的凋亡死亡。目前已知，未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)在哺乳動物體內(nèi)存在著3條激活傳道通路:雙鏈RNA激活的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKRlikeERkinase，PERK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;需肌醇酶1(type-1endoplasmicreticu

6、lumtransmembraneproteinkinase，IRE1)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;活化轉(zhuǎn)錄因子6(activatingtranscriptionfactor6，ATF6)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。并由復(fù)雜的相關(guān)作用因子共同參與完成，其信號分子主要有GRP78、IRE1、ATF6、XBP1和PERK等。GRP78(glucoseregulatedproteinof78)為UPR最重要的伴侶蛋白和調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子，UPR過程中其轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，可被認

7、為UPR激活的標志分子;ATF6(activatingtranscriptionfactor6)是UPR過程中轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)激信號的重要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，其活化直接導(dǎo)致UPR中ATF6通路下游元件轉(zhuǎn)錄激活，其激活情況可被用于明確UPR中ATF6通路激活情況;XBP1（Xbox-bindingprotein1）是UPR靶基因的激活因子，在UPR的IRE1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，IRE1(inositolrequiring1)對其特異性的剪切，將非剪接型XBP

8、1-u轉(zhuǎn)化為剪接型XBP1-s，從而提高其活性和引發(fā)下游效應(yīng)，因而非剪接型XBP1-u與剪接型XBP1-s的表達差異決定了UPR中IRE1通路激活情況。
　　目前已有相關(guān)研究證實，UPR在許多實體腫瘤，如乳腺癌、胃癌、肝癌、膽管癌、前列腺癌等中被激活，但ESCC組織中激活情況及其作用機制的研究并不完善。腫瘤細胞UPR在內(nèi)的ERS，作為潛在的藥物作用靶點已經(jīng)普遍受到人們的重視，伴隨著ERS學(xué)說研究的不斷深入及完善，有望使我們更加充分

9、了解實體腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，從而提供新的實體腫瘤治療靶點及預(yù)防途徑。
　　本實驗分別采用免疫組化SP及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscriptasePCR，RT-PCR)法檢測ESCC組織中GRP78、ATF6及XBP1的表達，并分析其在ESCC組織及正常食管組織中表達的差異及其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，探討ESCC組織中UPR存在情況及其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系的意義。為食管癌的診斷及治療提供新的思路。<

10、br>　　對象與方法
　　1.收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科2011年11月至2013年9月間經(jīng)手術(shù)切除且經(jīng)病理證實的原發(fā)性ESCC組織及距癌組織5cm以上的手術(shù)遠端切緣正常食管黏膜組織各99例，所有病例術(shù)前未經(jīng)放、化療治療。其中男性62例，女性37例;年齡38～73歲，≤60歲27例，＞60歲72例。分化程度:低分化32例，中分化53例，高分化14例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況:存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例。
　　2.

11、應(yīng)用免疫組化SP的方法檢測99例食管鱗狀細胞癌組織及其相應(yīng)正常食管組織中GRP78和ATF6兩種蛋白的表達情況;應(yīng)用RT-PCR方法分析XBP1兩種不同的亞型（非剪接型XBP1-u，剪接型XBP1-s）在食管鱗狀細胞癌組織及其相應(yīng)正常食管組織中表達分布情況;并分別分析GRP78、ATF6、XBP1-u、XBP1-s的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系。
　　3.采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組定性資料之間的比較采用

12、x2檢驗法進行，GRP78及ATF6蛋白在ESCC組織和正常食管組織中表達情況對比采用配對x2檢驗;在ESCC組織不同病理特征因素中表達情況使用獨立樣本x2檢驗進行;兩組定量資料之間的比較采用t檢驗法進行，XBP1-u及XBP1-smRNA在ESCC組織和正常食管組織中相對表達量采用配對t檢驗;XBP1-smRNA在ESCC組織中表達情況采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
　　結(jié)果
　　1.GRP78在99例ESCC

13、組織陽性表達高于正常食管組織，二者分別為67/99(67.7％)，37/99(37.4％)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　2.GRP78在高、中、低分化組的表達遞增，分別為6/14(42.9％)，35/53(66％)，26/32(81.3％)，三者差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達高于不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，分別為26/30(86.7％)，41/69(59.4％)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05

14、)。GRP78表達與性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)。
　　3.ATF6在99例ESCC組織陽性表達高于正常食管組織，分別為62/99(62.6％)，35/99(35.6％)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　4.ATF6在高、中、低分化組的表達遞增，分別為5/14(35.7％)，32/53(60.4％)，25/32(78.1％)，三者差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達高于不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

15、組，分別為25/30(83.3％)，37/69(53.6％)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。ATF6表達與性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)。
　　5.XBP1-smRNA在ESCC組織中表達高于正常食管組織，分別為0.446±0.033，0.217±0.018，二者存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);
　　6.XBP1-smRNA在中、高分化組的表達低于低分化組，分別為0.437±0.035，0.450±0.041，兩者差異存在

16、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達高于不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，分別為0.448±0.040，0.436±0.032，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);。XBP1-smRNA表達與性別、年齡等因素?zé)o關(guān)(P＞0.05);
　　7.XBP1-umRNA在ESCC組織及正常食管組織中表達分別為0.191±0.016，0.188±0.013，二者無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);
　　8.XBP1-umRNA表達與性別、年齡

17、、高低分化、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征因素?zé)o統(tǒng)計學(xué)相關(guān)，均(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1.GRP78、ATF6、XBP1-smRNA在食管鱗狀細胞癌組織中高表達以及XBP1-umRNA在兩種組織中表達無差異，結(jié)果提示未折疊蛋白反應(yīng)在食管鱗狀細胞癌組織中存在激活情況;未折疊蛋白反應(yīng)中ATF6信號通路開放參與食管鱗癌的發(fā)生;未折疊蛋白反應(yīng)中IRE1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路開放參與食管鱗癌的發(fā)生;未折疊蛋白反應(yīng)與食管鱗癌的發(fā)生存在