GRP78和Calreticulin在人骨肉瘤組織中的表達及其意義.pdf

1、骨肉瘤(Osteosarcoma)是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，僅次于漿細胞瘤在原發(fā)性骨腫瘤中占第二位，以能夠產生骨樣組織的梭形基質細胞為特征。多見于青少年。近30年來，隨著新輔助化療廣泛應用，骨肉瘤的5年生存率己大大提高。骨肉瘤治療現在正處在一個新的階段，必須尋找骨肉瘤標志物以判斷其生物學特性和預后，并且要尋找臨床治療有效的分子靶向。 葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein，GRP78)，又名

2、免疫球蛋白重鏈結合蛋白(the immu-noglobulin heavy chain binding protein，Bip)，是主要的內質網伴侶蛋白，具有鈣離子粘合性和抗凋亡的特性。近年來研究表明GRP78在某些腫瘤細胞中呈高表達，對于腫瘤細胞的抗化療藥物的性質及抗原表達有重要意義。一些研究表明，GRP78可以促進腫瘤細胞增殖和存活，提高腫瘤細胞的抗藥耐藥性，以及加速惡性腫瘤的轉移。并且，GRP78還可以影響細胞凋亡途徑或其他信號途

3、徑中的組成因子，比如阻止PKC-ε/ERK/AP-1信號級聯(lián)；抑制caspase-7和Bax活化。在實體腫瘤的微環(huán)境下，GRP78的應激產生可以對抗針對G1期和S期產生毒性的化學藥物。并且還可以減少腫瘤細胞的凋亡，并且通過影響凋亡效應器的作用來阻斷化學藥物引起的細胞死亡。因此，GRP78可作為腫瘤生長和治療效果的一個生物標記。近期的研究已經證實，在一些癌細胞中，將GRP78作為分子靶向可促進細胞凋亡，并且可克服癌細胞的抗藥耐藥性。

4、 鈣網織蛋白(Calreticulin，CRT)也是一種內質網蛋白，具有一些獨特的功能，比如伴侶蛋白活性和調節(jié)Ca2+。研究發(fā)現鈣網織蛋白可增加Ca2+通過內質網的流動，卻降低了線粒體Ca2+濃度并降低了膜電位。因此，Ca2+在內質網和線粒體兩個細胞器之間的周轉增加可能會損壞線粒體，這樣可以增強癌細胞對凋亡信號刺激的感受性。另外的一些研究也表明，鈣網織蛋白過表達的癌細胞對藥物和放射誘發(fā)的細胞凋亡更加的敏感，而鈣網織蛋白缺乏的癌細胞對紫

5、外線誘導的細胞凋亡更具抵抗性。此外，鈣網織蛋白過表達還可以阻止Akt信號轉導、通過改變Ca2+穩(wěn)態(tài)來調節(jié)p53功能，以調整放射誘發(fā)的細胞凋亡。 本實驗旨在研究GRP78和Calreticulin兩種蛋白在人骨肉瘤組織中是否有表達，并比較骨肉瘤組織及正常組織表達的差異：化療前后表達的差異；遠隔轉移及未轉移之間的差異。依此來推斷這兩種蛋白在骨肉瘤組織中的表達與骨肉瘤生長、轉移的關系以及化療對其表達的影響。 一、GRP78在人

6、骨肉瘤組織中表達及其意義的實驗研究 目的: 盡管目前許多研究已經表明GRP78在許多惡性腫瘤中呈高表達，并與其惡性程度和侵襲力呈正相關，通過化療可以使其表達降低。但目前還沒有關于GRP78在人骨肉瘤組織中表達及其與轉移、化療藥物之間關系的研究。本研究的目的為應用不同的實驗方法來檢測GRP78在人骨肉瘤組織中的表達，并比較骨肉瘤組織及正常組織表達的差異；化療前后表達的差異；遠隔轉移及未轉移之間的差異，并依此來推斷這GRP78在骨肉

7、瘤組織中的表達與骨肉瘤生長、轉移的關系以及化療對其表達的影響，以期能為骨肉瘤治療和預后評估提供實驗和理論依據。 方法: 1.免疫組織化學染色法檢測GRP78在不同部位組織中的表達 取骨肉瘤標本30例，其中未轉移者5例，轉移者25例；術前化療者20例，術前未化療者10例。每例標本同時取瘤體組織及正常組織作對照。取新鮮組織標本在-20℃下做冰凍切片進行免疫熒光染色。 2.RT-PCR法檢測GRP78在不同部位

8、組織中的表達 取新鮮組織碾碎后抽提組織總RNA，然后用RT-PCR試劑盒進行RT-PCR。將電泳圖移入圖像分析系統(tǒng)進行表達強度測定。 3.Western-Blot法檢測GRP78在不同部位組織中的表達 取新鮮標本碾碎提取蛋白質后進行Western-Blot。將膠片掃描入圖像分析系統(tǒng)進行表達強度測定。 結果: 1.免疫組織化學染色法檢測GRP78在不同部位組織中的表達 組織細胞胞漿被染為綠色

9、為陽性。GRP78主要存在于細胞內質網膜上染色深時為全胞漿綠色，淺時為類泡樣胞漿綠染。GRP78的表達強度為瘤體組織>瘤體周圍正常組織；腫瘤轉移組>未轉移組，術前未化療組>術前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉移組和未轉移組，術前未化療組和術前化療組表達量有顯著差異。 2.RT-PCR法檢測GRP78在不同部位組織中的表達 GR2P78在所有標本中均有表達。GRP78的表達強度為瘤體組織>瘤體周圍正常組織，腫瘤轉

10、移組>未轉移組，術前未化療組>術前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉移組和未轉移組，術前未化療組和術前化療組表達量有顯著差異。 3.Westen-Blot法檢測GRP78在不同部位組織中的表達 GRP78在所有標本中都有表達。GRP78的表達強度為瘤體組織>瘤體周圍正常組織，腫瘤轉移組>未轉移組，術前未化療組>術前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉移組和未轉移組，術前未化療組和術前化療組表達量有顯著差異。

11、 二、Calreticulin在人骨肉瘤組織中表達及其意義的實驗研究 目的: 盡管目前許多研究已經表明Calreticulin在許多惡性腫瘤中表達，并與腫瘤生長和治療反應有密切關系。但目前還沒有關于Calreticulin在人骨肉瘤組織中表達及其與轉移、化療藥物之間關系的研究。本研究的目的為應用不同的實驗方法來檢測Calreticulin在人骨肉瘤組織中的表達，并比較骨肉瘤組織及正常組織表達的差異；化療前后表達的差異；遠

12、隔轉移及未轉移之間的差異，并依此來推斷Calreticulin在骨肉瘤組織中的表達與骨肉瘤生長、轉移的關系以及化療對其表達的影響，以期能為骨肉瘤治療和預后評估提供實驗和理論依據。 方法: 1.免疫組織化學染色法檢測Calreticulin在不同部位組織中的表達 取骨肉瘤標本30例，其中未轉移者5例，轉移者25例；術前化療者20例，術前未化療者10例。每例標本同時取瘤體組織及正常組織作對照。取新鮮組織標本在-20℃

13、下做冰凍切片進行免疫熒光染色。 2.RT-PCR法檢測Calreticulin在不同部位組織中的表達 取新鮮組織碾碎后抽提組織總RNA，然后用RT-PCR試劑盒進行RT-PCR。將電泳圖移入圖像分析系統(tǒng)進行表達強度測定。 3.Western-Blot法檢測Calreticulin在不同部位組織中的表達 取新鮮標本碾碎提取蛋白質后進行Western-Blot。將膠片掃描入圖像分析系統(tǒng)進行表達強度測定。

14、 結果: 1.免疫組織化學染色法檢測Calreticulin在不同部位組織中的表達 組織細胞胞漿被染為綠色為陽性。Calreticulin主要存在與內質網網腔內。染色為胞漿顆粒狀綠染。綠色強度代表表達量。GRP78和Calreticulin在所有標本中都有表達。Calreticulin的表達強度為瘤體組織<瘤體周圍正常組織，腫瘤轉移組<未轉移組，術前未化療組<術前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉移組和未轉移組

15、，術前未化療組和術前化療組表達量有顯著差異。 2.RT-PCR法檢測Calreticulin在不同部位組織中的表達 Calreticulin在所有標本中均有表達。Calreticulin的表達強度為瘤體組織<瘤體周圍正常組織，腫瘤轉移組<未轉移組，術前未化療組<術前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉移組和未轉移組，術前未化療組和術前化療組表達量有顯著差異。 3.Westen-Blot法檢測Calretic

16、ulin在不同部位組織中的表達 Calreticulin在所有標本中都有表達。Calreticulin的表達強度為瘤體組織<瘤體周圍正常組織，腫瘤轉移組<未轉移組，術前未化療組<術前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉移組和未轉移組，術前未化療組和術前化療組表達量有顯著差異。 結論: 本課題首次在人骨肉瘤組織中檢測到GRP78和Calreticulin的表達，運用免疫組織化學染色法、RT-PCR法和Western-

17、Blot法比較了骨肉瘤是否轉移和是否經過化療后GRP78和Calreticulin的表達變化。結果發(fā)現GRP78的表達骨肉瘤組織高于正常組織，發(fā)生轉移患者的表達高于未轉移患者，未化療者高于化療者。 本研究表明，GRP78可刺激腫瘤增殖、存活、轉移，并且對化療藥物治療有相應的反應。而Calreticulin的過表達可使骨肉瘤患者對化療藥物的治療更加敏感。因此，GRP78和Calreticulin可作為骨肉瘤行為和治療反應的分子靶向