原核蛋白GRP78對單核細胞分化的影響及分泌型Grp78真核表達載體的構(gòu)建和表達.pdf

1、目的：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78），又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP），是熱休克蛋白70（HSP70）家族的重要成員。GRP78最初被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中作為分子伴侶，對蛋白質(zhì)的正確折疊組裝起著重要作用，而在腫瘤細胞中GRP78可以被誘導表達，進而促進腫瘤細胞的增殖、抗凋亡以及增加腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。近來發(fā)現(xiàn)GRP78不僅存在于細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，也可以轉(zhuǎn)移到細胞膜甚至可以分泌到細胞外，而分泌型GRP78作為腫瘤微環(huán)境的組成部分對腫

2、瘤的作用還不完全清楚。結(jié)合實驗室前期研究基礎，GRP78對免疫細胞特別對樹突狀細胞的生長分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究探討腫瘤細胞分泌的GRP78作為腫瘤微環(huán)境的組成部分，對腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞產(chǎn)生的影響。
　　方法：⑴利用PMA可以促進單核細胞THP1向巨噬細胞分化這一研究模型，研究GRP78對巨噬細胞極化的影響。提取純化原核表達蛋白GRP78與丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）共同刺激單核細胞THP1，并分組設立GRP78濃度梯度10

3、ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml，刺激72h后收集細胞用流式細胞儀檢測細胞表面標志CD163、FGL2。用Trizol提取細胞的RNA，利用RT-PCR方法檢測FIZZ1、IL10、TGFβ、ARG1和iNOS等分子的RNA表達。⑵設計與GRP78編碼序列互補的引物對，引入Xho I和Hind III酶切位點，取實驗室前期構(gòu)建的人來源GRP78原核表達載體pGEX-4T-3-GRP78為模板，PCR擴增人GRP

4、78基因(去內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號中的KDEL序列）；將GRP78基因片段及PET42a空載質(zhì)粒均用Xho I和Hind III酶切處理后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收帶有相同黏性末端的片段用T4連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌，并挑取陽性菌落擴增提取質(zhì)粒酶切鑒定，將酶切正確的質(zhì)粒送公司測序，保留測序正確的質(zhì)粒pET-42a-GRP78及菌種。同理，設計與GRP78編碼序列互補的引物對，引入6個His標簽及Pst I和BamH I酶切位點

5、，以前述pET42a-GRP78載體為模板，擴增目的基因。GRP78基因片段及pIRES2-EGFP空載質(zhì)粒均用Pst I和BamH I酶切處理后回收帶有相同黏性末端的片段，用 T4連接酶連接,其他實驗步驟如前述，測序后保存pGIE質(zhì)粒及菌種。⑶提取pGIE質(zhì)粒，用Pst I限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒線性化并凝膠電泳回收。用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將回收的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞DU145，用G418進行抗性篩選并進行單克隆化，在

6、熒光顯微鏡下觀察挑選出帶有綠色熒光的細胞進行擴大培養(yǎng)，并進行多次傳代培養(yǎng)。對穩(wěn)定帶有熒光的細胞，進一步進行流式細胞術鑒定，并用Elisa檢測細胞上清中GRP78的分泌。選取分泌GRP78的細胞進行保存培養(yǎng)及后續(xù)的實驗。
　　結(jié)果：①GRP78刺激單核細胞THP1后，F(xiàn)CM檢測顯示CD163表達升高，且隨著GRP78刺激濃度升高而增加，RT-PCR檢測顯示在GRP78濃度為40ng/ml時FIZZ1、TGFβ有明顯的升高，F(xiàn)GL2的

7、表達則隨著GRP78濃度的增加而降低，而IL10、ARG1、iNOS的表達變化不明顯。②目的基因片段與pIRES2-EGFP空載體連接后，挑取篩選后藍白斑陽性菌落擴增并提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定篩選出質(zhì)粒大小符合理論值（約7kb）的質(zhì)粒，酶切后電泳鑒定進一步篩選出符合預期大小的質(zhì)粒樣品，測序結(jié)果與GRP78-?KDEL基因序列相符，所編碼氨基酸序列完全一致，結(jié)果表明pGIE真核核表達載體構(gòu)建成功。③在熒光顯微鏡下，觀察轉(zhuǎn)染pGIE質(zhì)粒

8、的DU145細胞形態(tài)及綠色熒光的表達，選取熒光強度較強的細胞進行單克隆化并繼續(xù)G418加壓篩選，選取熒光強度強的細胞擴大培養(yǎng)，并用流式細胞儀進行綠色熒光檢測，收集轉(zhuǎn)染以及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞上清ELISA檢測，ELISA檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了pGIE質(zhì)粒的DU145細胞上清中GRP78較未轉(zhuǎn)染的有明顯升高。
　　結(jié)論：⑴GRP78可以促進單核細胞THP1表面CD163、FIZZ1、TGFβ分子的表達，而抑制FGL2的表達，提示GRP78可