miRNA-493靶向E2F1和RhoC抑制肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的：
　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，近十年其發(fā)病率和死亡率均迅速上升，在我國高居惡性腫瘤死亡率的首位，已成為嚴(yán)重威脅人們生命健康的重大疾病。根據(jù)肺癌的生物學(xué)特性，分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC約占80-85％，近年來，隨著治療方式的改進(jìn)，治療方案的調(diào)整，肺癌的治療取得了長足的進(jìn)步，但是大部分的NSCLC患者預(yù)后仍然較差，5年生存率仍低于15％。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者死亡的最主要

2、原因之一，對肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制研究雖然取得了很大的成績，然仍尚不明確。越來越多的研究證據(jù)提示了miRNAs等表觀遺傳學(xué)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常肺細(xì)胞，miR-493在肺癌細(xì)胞中表達(dá)普遍較低，以高轉(zhuǎn)移潛能的非小細(xì)胞肺癌95D細(xì)胞株尤為明顯。本研究擬在此基礎(chǔ)上，通過建立過表達(dá)miR-493的95D穩(wěn)定細(xì)胞株，利用一系列的分子細(xì)胞生物學(xué)方法對miR-493的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，并對miR-493的靶基因進(jìn)行預(yù)

3、測和驗(yàn)證，進(jìn)一步探討miR-493在肺癌中的調(diào)控機(jī)制。為開發(fā)miRNA成為腫瘤多種生物學(xué)行為的分子標(biāo)志物提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　(1)構(gòu)建miR-493慢病毒載體及空白對照載體，分別轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞，建立過表達(dá)miR-493的穩(wěn)定細(xì)胞系95D/miR-493，以及對照組95D/control。并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。
　　(2)應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞生長曲線檢測各組細(xì)胞的增殖能力，流式分析細(xì)胞周期

4、，Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，Hoechst染色檢測凋亡和MTS法檢測藥物敏感性等生物學(xué)行為的變化。
　　(3)采用實(shí)時(shí)定量PCR、WesternBlot技術(shù)檢測95D、95D/control和95D/miR-493細(xì)胞中RhoC、FZD4、IGF1R這3個(gè)靶基因的表達(dá)情況。
　　(4)利用RNAi技術(shù)干擾肺癌細(xì)胞中RhoC的表達(dá)水平，MTS法檢測干擾前后細(xì)胞5天（每天檢測一次）的生長狀況并繪制生長

5、曲線評價(jià)細(xì)胞的增殖能力。Transwell檢測處理前后細(xì)胞的侵襲能力的變化。Western blot檢測95D/miR-493和95D/si-RhoC及其各自的對照組細(xì)胞MMP2和MMP9的表達(dá)情況。
　　(5)利用生物信息學(xué)在線預(yù)測軟件分析并結(jié)合生物學(xué)功能及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出miR-493可能的靶基因E2F1。采用實(shí)時(shí)定量PCR、WestemBlot技術(shù)檢測95D、95D/control和95D/miR-493細(xì)胞中E2F1的

6、表達(dá)情況。將miR-493和重組有E2F1的3'UTR區(qū)序列的熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，24h后檢測報(bào)告基因的活性。
　　(6)利用RNAi技術(shù)干擾肺癌細(xì)胞中E2F1的表達(dá)水平，采用流式細(xì)胞術(shù)分析干擾E2F1前后的細(xì)胞周期分布，采用MTS法檢測干擾前后細(xì)胞5天（每天檢測1次）的生長狀況并繪制生長曲線評價(jià)細(xì)胞增殖能力。Westem blot檢測95D/miR-493和95D/si-E2F1及對照組細(xì)胞p21、cyclin D

7、2、ERK的表達(dá)及磷酸化狀況。
　　結(jié)果：
　　(1)以95D組中miR-493的相對表達(dá)量作為1，95D/con組和95D/miR-493組中miR-493相對表達(dá)量分別為(1.02±0.34)、(10.65±0.59)，過表達(dá)組(95D/miR-493)中miR-493的表達(dá)水平明顯高于空白組(95D)和陰性對照組(95D/control)(p＜0.01)。
　　(2)外源性過表達(dá)miR-493能使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯

8、，G0/G1期細(xì)胞比例增多(80.77±4.22)％VS95D/control(43.70±2.33)％，S期細(xì)胞比例顯著減少(9.81±0.56)％VS95D/control(43.07±2.14)％;肺癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯受抑制(p＜0.05)，而細(xì)胞凋亡和藥物敏感性方面無明顯變化。
　　(3)miR-493在95D細(xì)胞能抑制RhoC的表達(dá)而對FZD4和IGF1R表達(dá)無影響。RhoC的表達(dá)沉默能抑制95D細(xì)胞的侵

9、襲能力而對增殖能力無影響。95D/miR-493、95D/si-RhoC中的MMP2和MMP9的表達(dá)量均明顯低于其相應(yīng)對照組。
　　(4)利用生物信息學(xué)在線預(yù)測軟件分析并結(jié)合生物學(xué)功能及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出miR-493可能的靶基因E2F1。實(shí)時(shí)定量PCR及WesternBlot發(fā)現(xiàn)E2F1的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)均與miR-493成負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)miR-493對E2F1表達(dá)具有直接抑制作用。
　　(5)E2

10、F1的表達(dá)沉默能使95D細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例增高，S期細(xì)胞比例減少，生長曲線結(jié)果顯示E2F1干擾后細(xì)胞增殖速度減慢。95D/miR-493、95D/si-RhoC細(xì)胞cyclinD2表達(dá)明顯低于對照組細(xì)胞，P21表達(dá)均高于對照細(xì)胞，ERK磷酸化程度明顯低于對照組。
　　結(jié)論：
　　(1)成功建立了過表達(dá)miR-493的穩(wěn)定細(xì)胞株95D/miR-493及其對照細(xì)胞株。
　　(2)miR-493能抑制95D肺癌細(xì)胞增殖