靶向封閉AKT1抑制肝癌細胞增殖和遷移的研究.pdf

1、目的：超過90%的原發(fā)性肝癌為肝細胞癌（HCC），HCC的預后較差。雖然手術治療仍是迄今為止最有效的治療，但大多數(shù)HCC患者被診斷時處于晚期，不能接受手術治療，而未經(jīng)治療的患者5年存活率僅為5%。因此，探索HCC新的治療靶點以發(fā)掘HCC新的有效可行的治療方法是至關重要的。PI3K/AKT/mTOR信號通路已經(jīng)被越來越多的研究證明其在 HCC的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用。AKT是PI3K/AKT/mTOR信號通路的重要橋梁點，已經(jīng)有證據(jù)表明其

2、對調節(jié)細胞活力信號方面起重要作用，并且與各種增殖性疾病密切相關。許多數(shù)據(jù)表明，單一AKT的亞型（即AKT1，AKT2和AKT3）在調節(jié)癌細胞增殖、遷移和侵襲中具有不同甚至相反的功能。AKT同種異型可能對癌癥傳播具有不利影響。AKT家族，也叫絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，特別是AKT1亞型已被確定在HCC細胞中異常表達，并且與細胞行為（包括增殖，存活，代謝和腫瘤發(fā)生）高度相關。然而，AKT1的調節(jié)具體機制需要進一步研究。我們的研究的目的是揭示A

3、KT1對HCC細胞增殖和遷移的影響，并調查其所涉及的機制。
　　方法：用TRIzol試劑從HCC細胞（SMMC-7721，HepG2）中提取總RNA，SYBR Premix Ex Taq試劑對cDNA樣品進行實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測基因的表達。我們使用RT-PCR來評估兩個HCC細胞系（SMMC-7721和HepG2）中AKT1的表達水平。按照質粒提取試劑盒說明書提取空白質粒和AKT1-RNAi質粒。提取出來的質粒用

4、Effectene轉染試劑進行轉染。轉染48小時后，用PT-PCR檢測轉染效率。Western blot用來檢測AKT1對分子蛋白調節(jié)機制的影響，MTT法檢測AKT1的表達對HCC細胞生長增殖的影響，細胞劃痕實驗用來檢測SMMC-7721和HepG2細胞的遷移能力。所有實驗重復三次。
　　結果：與正常肝細胞系HL-7702中的表達水平相比，SMMC-7721和HepG2肝癌細胞系中 AKT1的表達明顯顯著上調（**P＜0.01）。

5、然后我們評估了下調質粒（AKT1-RNAi質粒）的轉染效率。相應結果是下調質粒抑制了AKT1的表達，表明轉染有效。進行MTT測定以了解AKT1在HCC細胞增殖中的作用，結果顯示AKT1-RNAi質粒下調AKT1的表達可抑制細胞增殖（P＜0.05）。AKT1-RNAi質粒轉染的SMMC-7721和HepG2細胞的傷口愈合的能力明顯顯著降低（**P＜0.01）。此外，封閉AKT1后可通過抑制NF-κB的轉錄激活和下調MMP-2、MMP-9的

6、活性和表達來抑制HCC細胞系的增殖和遷移。（**P＜0.01）。在Western免疫印跡實驗中，與空白質粒轉染的細胞相比，敲除AKT1蛋白對NF-κB、MMP-2和MMP-9表達有明顯的影響。相于空白質粒轉染細胞，AKT1-RNAi質粒轉染細胞MMP-2和MMP-9活性較低（**P＜0.01）。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)，在HCC細胞中下調AKT1抑制了其介導的NF-κB的表達和分泌（**P＜0.01）。
　　結論：我們的研究結果顯示AK