PRRX1下調(diào)對非小細胞肺癌細胞增殖和凋亡的作用及機制的研究.pdf

1、第一部分：PRRX1在非小細胞肺癌中的組織學表達特征及臨床意義
　　目的：通過檢測PRRX1在非小細胞肺癌患者中的表達情況，結合患者臨床資料，了解PRRX1在肺癌中臨床價值。
　　方法：利用免疫組化法檢測52例非小細胞肺癌組織標本和28例癌旁正常肺組織標本中PRRX1表達情況，結合患者的臨床病理資料和預后情況，應用Kaplan-Meier生存分析法和COX比例風險回歸模型分析PRRX1與患者預后的關系。
　　結果：1.

2、免疫組化結果顯示PRRX1在癌旁正常肺組織中呈現(xiàn)穩(wěn)定中度表達；在非小細胞肺癌組織中PRRX1高度表達存在高分化的肺癌組織中，PRRX1中低表達存在中度分化的肺癌組織中，PRRX1低表達或者表達缺失存在于低分化的肺癌組織中。2.低表達PRRX1與患者的腫瘤大小分期，疾病分期和腫瘤分化程度相關（P=0.002, P=0.019和 P=0.001）。3. COX比例風險回歸模型多因素分析顯示淋巴結分期、疾病分期和PRRX1表達水平是患者預后的

3、獨立因素(Cox回歸分析：P=0.048, P=0.008和P=0.035)。4.PRRX1低表達患者生存周期較高表達者縮短（log-rank檢驗，P=0.010）。
　　結論：PRRX1的表達情況與非小細胞肺癌患者的疾病分期、細胞分化、預后相關。低表達的PRRX1提示患者預后差。
　　第二部分：沉默PRRX1誘導A549細胞經(jīng)歷EMT和獲得CSCs特性
　　目的：構建PRRX1基因沉默的PRRX1-shRNA-A54

4、9細胞模型，進一步研究在A549細胞中沉默PRRX1與EMT和CSCs特性的關系。
　　方法：通過shRNA技術沉默A549細胞中PRRX1表達，構建PRRX1-shRNA-A549細胞模型。Western blot實驗驗證模型構建情況，應用MTT和軟瓊脂克隆生長實驗觀察模型細胞的增殖能力，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化。Transwell體外侵襲、入侵實驗和創(chuàng)傷愈合實驗檢測模型細胞的侵襲和移動能力。Western blot實驗和免

5、疫熒光實驗觀察模型細胞的上皮和間質(zhì)標志物表達情況。流式細胞儀分選模型細胞上肺癌CSCs標志物比例。
　　結果：1. Western blot檢測結果顯示A549細胞中PRRX1為高表達，可以應用基因沉默技術構建細胞模型。2.成功構建PRRX1-shRNA-A549、Mock-shRNA-A549細胞模型，Western blot實驗顯示PRRX1表達明顯抑制在基因沉默細胞模型中。3.MTT和軟瓊脂克隆生長實驗結果顯示，沉默PRRX

6、1后，細胞貼壁和非貼壁增殖情況明顯受到增強。4.相差顯微鏡下可見，沉默PRRX1后，A549細胞形態(tài)向間質(zhì)細胞表型特征轉化。5. Transwell體外侵襲、入侵實驗和創(chuàng)傷愈合實驗顯示，沉默PRRX1后，細胞的移動和侵襲能力增強。6.沉默PRRX1后，A549細胞的間質(zhì)細胞標志物Vimentin和N-cadherin表達上調(diào)，上皮細胞標志物E-cadherin下調(diào)，并且免疫熒光實驗結果得到相一致的結果。7.流式細胞儀檢測結果，細胞沉默P

7、RRX1后，肺癌干細胞標準物（CD133、CD44、ALDH1）細胞比例提高，分別為77.6%、4.1%、1.5%。
　　結論：敲除PRRX1誘導肺腺癌細胞經(jīng)歷EMT，獲得CSCs特性，增強了細胞增殖、侵襲的能力。
　　第三部分：沉默PRRX1通過干擾caspase-3凋亡通道激活抑制順鉑誘導的A549細胞凋亡
　　目的：通過已經(jīng)建立的PRRX1-shRNA-A549細胞模型，觀察PRRX1沉默后，順鉑誘導的A549細

8、胞凋亡和凋亡通道的變化，探討PRRX1在順鉑誘導A549細胞凋亡中的作用機制。
　　方法：通過MTT實驗檢測PRRX1沉默后順鉑對于細胞增殖抑制情況，并選擇最佳順鉑實驗濃度。流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡情況。線粒體膜電位檢測線粒體體外膜電位的變化情況。Western blot實驗檢測凋亡相關蛋白（caspase-3, caspase-9, cytochrome C和 Apaf-1）的表達情況，判斷PRRX1沉默后細胞凋亡通道。

9、MTT實驗和細胞凋亡實驗中添加caspase-3激活劑PAC-1，反向驗證PRRX1沉默干擾的細胞凋亡通道。
　　結果：1. MTT實驗結果顯示，PRRX1沉默后阻止了順鉑誘導的A549細胞增殖抑制，順鉑濃度為20μg/ml是后續(xù)實驗最佳濃度。2.流式細胞儀檢測細胞凋亡實驗結果顯示，PRRX1沉默后，細胞凋亡明顯受到抑制。3.流式細胞儀檢測細胞周期實驗結果顯示，PRRX1沉默后，細胞周期阻滯在G2期。4.線粒體膜電位檢測結果顯示，