蛋白攝入水平對(duì)早產(chǎn)學(xué)習(xí)認(rèn)知能力及mTOR-S6K通路的影響.pdf

1、背景：隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是危重新生兒救治水平的提高，早產(chǎn)兒，特別是出生體重低于1500g的極低/超低出生體重兒(Very Low BirthWeight/Extremely Low Birth Weight，VLBW/ELBW)的存活率明顯提高。雖然早產(chǎn)兒存活率大大提高，但神經(jīng)發(fā)育障礙并未成比例的下降。早產(chǎn)兒中腦性癱瘓(cerebral palsy，CP)的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。存活早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育的遠(yuǎn)期問(wèn)題主要為腦性癱瘓、認(rèn)知

2、能力障礙、智力障礙以及視聽(tīng)覺(jué)缺陷。即使有部分早產(chǎn)兒并無(wú)以上的損傷，但卻表現(xiàn)為隱性殘疾（如:情緒不受控、注意力無(wú)法集中、閱讀書寫能力差等。早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育障礙與窒息、病理性黃疸、顱內(nèi)出血、缺氧缺血性腦病等早產(chǎn)兒并發(fā)癥有關(guān)外，早產(chǎn)兒營(yíng)養(yǎng)對(duì)神經(jīng)發(fā)育結(jié)局的影響是備受各國(guó)學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)之一，如何做到最佳的營(yíng)養(yǎng)支持方案這一直是醫(yī)學(xué)界丞待解決的問(wèn)題。Lucas教授提出“營(yíng)養(yǎng)程序化”(nutritional programming)的概念，即在發(fā)育的關(guān)鍵

3、期或敏感期的營(yíng)養(yǎng)狀況將對(duì)機(jī)體或各器官功能產(chǎn)生長(zhǎng)期乃至終生的影響，其臨床研究也表明，在關(guān)鍵期給予早產(chǎn)配方奶（高蛋白）更有利于神經(jīng)發(fā)育。Singhal等學(xué)者則發(fā)現(xiàn)，雖然強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)配方喂養(yǎng)組比起標(biāo)準(zhǔn)配方喂養(yǎng)組神經(jīng)發(fā)育更優(yōu)，但青春期時(shí)胰島素抵抗和高血壓等代謝性疾病的發(fā)生率卻更高。大腦發(fā)育是個(gè)漫長(zhǎng)而又極其復(fù)雜的過(guò)程，涉及神經(jīng)細(xì)胞的分化、增殖，神經(jīng)滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、增殖，腦及腦區(qū)的形成等，不同的發(fā)育階段對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的需求，除“關(guān)鍵期”營(yíng)養(yǎng)干預(yù)可影響早產(chǎn)

4、幾神經(jīng)發(fā)育外，是否在“關(guān)鍵期”后實(shí)施營(yíng)養(yǎng)干預(yù)也能影響早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育，并且還能降低早產(chǎn)兒追趕生長(zhǎng)帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)，這是一個(gè)非常值得探討的課題。哺乳類動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyoin，mTOR)是進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶(plosphatidylinOsitol3-kinase-related kinase，PIKK)蛋白質(zhì)家族的成員，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)

5、感受細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)、能量水平以及生長(zhǎng)因子等信號(hào)變化。mTOR不同結(jié)構(gòu)域和不同蛋白結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)主要形成兩種復(fù)合物，即mTOR-Raptor復(fù)合物(mTORC1)和mTOR-Richtor復(fù)合物（mTORC2）。正常情況下，生長(zhǎng)因子（如胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等）誘導(dǎo)mTOR的活化是通過(guò)激活PI3K實(shí)現(xiàn)的。PI3K可磷酸化3-磷酸肌醇，磷酸化的3-磷酸肌醇(PI3Ps)與Akt的PH區(qū)域連接導(dǎo)致Akt轉(zhuǎn)位至漿膜，從而與磷酸肌醇依賴

6、性激酶1(PDKI)接觸。PDKI負(fù)責(zé)Akt的磷酸化，從而激活A(yù)kt。激活的Akt可磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體2(tuberoussclerosiscomplex2，TSC2)并減弱后者對(duì)mTORC1的抑制作用。與生長(zhǎng)因子激活通路不同，營(yíng)養(yǎng)信號(hào)激活通路主要經(jīng)過(guò)AMPK途徑。AMPK受細(xì)胞內(nèi)ATP/AMP的調(diào)節(jié)當(dāng)ATP/AMP比例下調(diào)時(shí).AMPK被激活，活化的AMPK可磷酸化并激活TSC1/TSC2二聚體，抑制mTORC1，反之亦然?；罨膍

7、TORC1進(jìn)一步磷酸化S6K和4EBP，從而參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始、核糖體生物合成、細(xì)胞周期調(diào)控等。近年來(lái)，一系列的研究發(fā)現(xiàn)mTOR相關(guān)信號(hào)通路與突觸可塑性、學(xué)習(xí)、記憶功能，神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變及攝食等密切相關(guān)。mTOR信號(hào)通路在海馬的學(xué)習(xí)、記憶提取和記憶鞏固的蛋白翻譯過(guò)程中有著重要作用;mTOR信號(hào)通路是長(zhǎng)時(shí)程電位晚期成分形成的必要條件;脂肪貯存充足時(shí)，mTOR促進(jìn)來(lái)普汀的產(chǎn)生，來(lái)普汀依次傳遞能量過(guò)剩的信息給中樞神經(jīng)系，抑制攝食和

8、促進(jìn)能量消耗。然而目前的研究多集中在成年相關(guān)疾病，mTOR與新生兒特別是早產(chǎn)兒的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)研究較少，不同營(yíng)養(yǎng)條件下早產(chǎn)兒mTOR通路的活性及其生長(zhǎng)發(fā)育的影響還有待我們探討?，F(xiàn)行研究多集中在成年相關(guān)疾病，mTOR與新生兒特別是早產(chǎn)兒的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)研究較少，深入研究不同營(yíng)養(yǎng)條件下mTOR通路的活性改變對(duì)于探討早產(chǎn)兒生長(zhǎng)發(fā)育尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，優(yōu)化早產(chǎn)兒營(yíng)養(yǎng)支持方案具有重要意義。
　　 目的：通過(guò)建立早產(chǎn)大鼠模型，斷奶后給予不同的蛋

9、白質(zhì)飼料喂養(yǎng)至6周和8周，并通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變，并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、蛋白印跡法(western blot)技術(shù)分析mTOR/S6K通路活性的變化，探討關(guān)鍵期后不同的蛋白攝入水平對(duì)早產(chǎn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其可能機(jī)制，為優(yōu)化早產(chǎn)兒營(yíng)養(yǎng)支持方案提供依據(jù)。
　　 方法：過(guò)剖宮產(chǎn)法獲得新生SD早產(chǎn)大鼠，仔鼠由代乳母鼠哺乳至21日齡。將斷奶后的早產(chǎn)SD仔鼠和足月SD仔鼠采用機(jī)數(shù)字法分為6組:早產(chǎn)標(biāo)

10、準(zhǔn)蛋白組(A)、足月標(biāo)準(zhǔn)蛋白組(B)、早產(chǎn)低蛋白組(C)、足月低蛋白組(D)、早產(chǎn)高蛋白組(E)、足月高蛋白組(F)，每組大鼠34只。從第22日齡起，標(biāo)準(zhǔn)蛋白組、低蛋白組和高蛋白組給予標(biāo)準(zhǔn)蛋白飼料（含18％蛋白質(zhì)）、低蛋白飼料（含8％蛋白質(zhì)）和高蛋白飼料（含30％蛋白質(zhì)）喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每組大鼠分別在第6周和第8周進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變。同期免疫組織化學(xué)法觀察海馬mTOR分布。Western blot觀察

11、海馬mTOR、p-mTOR(Ser2448)、p70S6K、p-p70S6K(Thr389)、4EBP1表達(dá)和活性。
　　 結(jié)果：⑴6周齡大鼠逃避潛伏期比較:各組大鼠6周齡時(shí)定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的比較結(jié)果顯示，足月大鼠（足月高蛋白組、足月低蛋白組和足月標(biāo)準(zhǔn)蛋白組）的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短(P＜0.05)，并且每天縮短的速度較為穩(wěn)定，而早產(chǎn)大鼠（早產(chǎn)高蛋白組、早產(chǎn)低蛋白組和早產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白組）的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)的變化

12、趨勢(shì)與對(duì)足月大鼠不同，呈現(xiàn)出先快后慢的變化趨勢(shì)。早產(chǎn)大鼠在前3天的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短(P＜0.05)，但是在接下來(lái)的第4天其逃避潛伏期與第3天基本接近，變化不顯著（P＞0.05）。組間兩兩比較顯示，與足月大鼠比較，早產(chǎn)大鼠前3天的逃避潛伏期無(wú)顯著性差異，第4天逃避潛伏期，足月高蛋白組大鼠明顯低于早產(chǎn)高蛋白組大鼠(P＜0.05)。說(shuō)明6周齡的足月大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力強(qiáng)于早產(chǎn)大鼠。⑵早產(chǎn)大鼠6周齡和8周齡的逃避潛伏期比較:早產(chǎn)大鼠

13、8周齡時(shí)定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的比較結(jié)果顯示，其逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短(P＜0.05)，并且每天縮短的速度較為穩(wěn)定，而在6周齡時(shí)，早產(chǎn)大鼠的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)的變化趨勢(shì)與8周齡時(shí)不同，呈現(xiàn)出先快后慢的變化趨勢(shì)。6周齡早產(chǎn)大鼠在前3天的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短，但是在接下來(lái)的第4天其逃避潛伏期與第3天基本接近，變化不顯著(P＞0.05)。不同周齡間兩兩比較顯示，與6周齡早產(chǎn)大鼠比較，8周齡早產(chǎn)大鼠前3天的逃避潛伏期無(wú)

14、顯著性差異:第4天逃避潛伏期，8周齡早產(chǎn)高蛋白組大鼠明顯低于6周齡早產(chǎn)高蛋白組大鼠（P＜0.05）。⑶各組大鼠6周齡時(shí)空間探索實(shí)驗(yàn)的比較:在予蛋白含量相同飼料飼養(yǎng)的情況下，6周齡早產(chǎn)大鼠的原平臺(tái)所在象限時(shí)間和原平臺(tái)所在象限路程占總路程的百分比均明顯少于6周齡足月大鼠，差異具有顯著性(P＜0.05)。⑷不同蛋白飼料對(duì)6周齡足月大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響:不同蛋白飼料組足月大鼠6周齡時(shí)，各組大鼠的原平臺(tái)所在象限時(shí)間和原平臺(tái)所在象限路程占總路程的

15、百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。⑸不同蛋白飼料對(duì)8周齡足月大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響:不同蛋白飼料組足月大鼠8周齡時(shí)，各組大鼠的原平臺(tái)所在象限時(shí)間和原平臺(tái)所在象限路程占總路程的百分比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。⑹早產(chǎn)大鼠6周齡和8周齡時(shí)空間探索實(shí)驗(yàn)的比較:在予蛋白含量相同飼料飼養(yǎng)的情況下，8周齡早產(chǎn)高蛋白組大鼠的穿越原平臺(tái)時(shí)間和原平臺(tái)所在象限時(shí)間占總時(shí)間的百分比均明顯大于6周齡早產(chǎn)高蛋白組大鼠，差異具有顯著性（P＜0.05）

16、。⑺同種蛋白飼料對(duì)6周齡大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR表達(dá)的影響:免疫組化結(jié)果顯示，mTOR免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于大腦海馬CA1、CA3和齒狀回(DG)。其中海馬區(qū)CA1起始部及CA3起始部，陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)海馬其它部位多，著色更深。高倍鏡下，mTOR陽(yáng)性細(xì)胞邊界清晰，主要在胞漿著色。同種蛋白飼料6周齡各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，6周齡足月各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR陽(yáng)性細(xì)胞均比早產(chǎn)組多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

17、義(P＜0.05)。⑻不同蛋白飼料對(duì)6周齡足月大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR表達(dá)的影響:6周齡各組足月大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異并不明顯(P＞0.05)。⑼同蛋白飼料對(duì)8周齡大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR表達(dá)的影響:免疫組化結(jié)果顯示，mTOR免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于大腦海馬CA1、CA3和齒狀回(DG)。其中海馬區(qū)CA1起始部及CA3起始部陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)海馬其它部位多，著色更深。高倍鏡下，mTOR陽(yáng)性細(xì)胞邊界清

18、晰，主要在胞漿著色。同種蛋白飼料8周齡各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)中，8周齡足月低蛋白組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR陽(yáng)性細(xì)胞均比早產(chǎn)低蛋白組多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。8周齡標(biāo)準(zhǔn)蛋白飼料、高蛋白飼料足月組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR陽(yáng)性細(xì)胞與同齡同飼料喂養(yǎng)早產(chǎn)組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)mTOR陽(yáng)性細(xì)胞的差異不明顯(P＞0.05)。⑽早產(chǎn)大鼠6周齡和8周齡時(shí)mTOR表達(dá)的比較:在予蛋白含量相同飼

19、料飼養(yǎng)的情況下，與6周齡早產(chǎn)大鼠比較，8周齡早產(chǎn)大鼠海馬CA1和CA3區(qū)mTOR陽(yáng)性細(xì)胞增多，差異具有顯著性(P＜0.05)，其中8周齡早產(chǎn)高蛋白組mTOR陽(yáng)性細(xì)胞增加較為顯著。⑾6周齡大鼠海馬mTOR信號(hào)通路的變化：早產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(PS)、早產(chǎn)低蛋白(PL)、早產(chǎn)高蛋白(PH)組6周齡大鼠在海馬中的p-p70S6K(Thr389)的表達(dá)受嚴(yán)重抑制甚至不表達(dá)；早產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(PS)、早產(chǎn)低蛋白(PL)、早產(chǎn)高蛋白(PH)組6周齡大鼠在海馬中

20、的4EBP1的表達(dá)比同齡足月標(biāo)準(zhǔn)蛋白(PS)、足月低蛋白(PL)、足月高蛋白(PH)組的弱；早產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白、早產(chǎn)低蛋白、早產(chǎn)高蛋白組、足月標(biāo)準(zhǔn)蛋白(PS)、足月低蛋白、足月高蛋白組6周齡大鼠海馬中的mTOR、p-mTOR(Ser2448)、p70S6K的表達(dá)差異不大。⑿6周，8周齡各組大鼠海馬p-p70S6K/Actin免疫活性比值比較：6周周齡各組大鼠海馬p-p70S6K/Actin免疫活性比值比較，結(jié)果顯示，早產(chǎn)各組大鼠海馬p70S6

21、K磷酸化水平較同齡足月各組大鼠海馬p70S6K磷酸化水平明顯降低，以胎齡和蛋白水平為主要影響因素的雙向ANOVA分析提示胎齡有顯著性作用（F胎齡=8.233，P=0.014＜0.05）；8周周齡各組大鼠海馬p-p70S6K/Actin免疫活性比值比較，結(jié)果顯示，高蛋白組（早產(chǎn)高蛋白組合足月高蛋白組）大鼠海馬p70S6K磷酸化水平顯著升高，以胎齡和蛋白水平為主要影響因素的雙向ANOVA分析提示蛋白水平有顯著性作用（F蛋白水平=4.13，P

22、=＜0.05）。高蛋白組與低蛋白組的LSD事后檢驗(yàn)P=0.021＜0.05，高蛋白組與標(biāo)準(zhǔn)蛋白組的LSD事后檢驗(yàn)P=0.042＜0.05。
　　 結(jié)論：①在大鼠早期生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，早產(chǎn)可能嚴(yán)重影響大鼠大腦的功能，在大腦發(fā)育關(guān)鍵期后的發(fā)育過(guò)程中，短時(shí)間加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)的補(bǔ)給仍不能彌補(bǔ)早產(chǎn)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力造成的影響，其學(xué)習(xí)記憶能力明顯差于足月大鼠。②在隨后的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，高蛋白組早產(chǎn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到恢復(fù)并能追趕上足月大鼠。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)