輔因子與內(nèi)源質(zhì)粒對維生素C發(fā)酵生產(chǎn)的影響.pdf

1、本論文以普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)WSH-001和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)WSH-002的混合菌系為生產(chǎn)菌株,以強(qiáng)化二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C過程中2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-glueonic acid,2-KLG)的高效生產(chǎn)和揭示兩菌關(guān)系為目標(biāo),研究了稀土元素與B.megaterium內(nèi)源質(zhì)粒對2-KLG合成的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.

2、通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同稀土離子及稀土元素配合物,研究了稀土元素對2-KLG合成的影響,并以效果最為顯著的La3+為對象進(jìn)行了深入研究。結(jié)果表明,不同稀土離子在低濃度下(≤5 mmol/L)對2-KLG的合成代謝均有一定促進(jìn)作用;EDTA鑭、檸檬酸鑭均抑制2-KLG的合成,而1 mmol/L的草酸鑭能輕度提高2-KLG的產(chǎn)量(6.4％);在搖瓶中添加5mmol/L的La3+,發(fā)酵中后期菌體生長狀況得到了顯著改善,同時提高了2-KLG的

3、最終產(chǎn)量,并縮短了發(fā)酵周期,分析產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因是La3+抑制2-KLG還原酶的活性,從而減少了2-KLG的降解。在發(fā)酵罐(3.6L)中添加5mmol/L的La3+進(jìn)行分批發(fā)酵,平均山梨糖消耗速率和2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度相比于對照分別提高了12.4％和14.8％,發(fā)酵周期縮短了11.1％。
　　 2.根據(jù)基因組測序結(jié)果,B.megaterium WSH-002中含有3個野生型質(zhì)粒pBM-001、pBM-002、pBM-003,

4、大小分別為74,613bp,9,699bp和7,006bp,分別含有69、11、14個開放讀碼框(Open Reading Frame,ORF)。為了研究B.megaterium WSH-002內(nèi)源質(zhì)粒對2-KLG合成的影響,分別采用逐級升溫處理法、溫度和SDS交替處理法以及吖啶橙處理法對其進(jìn)行了質(zhì)粒消除。結(jié)果采用溫度和SDS交替處理法篩選得到了兩株不同的質(zhì)粒部分消除衍生株D1(消除質(zhì)粒pBM-001)和D13(消除質(zhì)粒pBM-001和

5、pBM-003)。最后采用吖啶橙處理法篩選得到了質(zhì)粒完全消除衍生株D123。
　　 3.比較了篩選得到的三個不同質(zhì)粒消除衍生株D1、D13、D123與出發(fā)菌株B.Megaterium WSH-002的形態(tài)、生長特征以及分別與K.vulgare搭配后的產(chǎn)酸情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),三株不同質(zhì)粒消除衍生株的形態(tài)特征和生長特征與出發(fā)菌株無顯著差異,說明這些質(zhì)粒不是B.megaterium WSH-002生長所必須的。分別與K.vulgare搭配

6、得到混菌體系后進(jìn)行產(chǎn)酸比較結(jié)果表明pBM-002和pBM-003對2-KLG的合成具有重要的影響,而質(zhì)粒pBM-001對2-KLG的合成幾乎沒有影響。根據(jù)B.megaterium WSH-002測序結(jié)果對其三個內(nèi)源質(zhì)粒上所有預(yù)測的96個ORF進(jìn)行了COG功能分類和蛋白比對,發(fā)現(xiàn)WSH-002的質(zhì)粒特別是pBM-002和pBM-003上存在大量未知功能蛋白或在數(shù)據(jù)庫中找不到同源的蛋白。說明B.megaterium WSH-002野生型質(zhì)粒