重組羧肽酶G2對甲氨蝶呤毒性和抗癌效應(yīng)影響.pdf

1、甲氨蝶呤(MTX)臨床主要用于小兒白血病、骨肉瘤、絨癌、乳腺癌等癌癥的治療，也可用于銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的治療。其不良反應(yīng)包括骨髓抑制、黏膜潰瘍和腎功能損傷等。MTX主要通過腎臟排泄，大部分藥物以原型排出體外。MTX具有腎臟毒性，一旦引起腎臟損傷會進(jìn)一步延緩排泄，使MTX清除延遲，繼而發(fā)生更嚴(yán)重的毒副作用，甚至引起患者死亡。
　　CPG2是一種細(xì)菌酶，能迅速的將MTX代謝為兩個非活性代謝產(chǎn)物:谷氨酸和2，4-氨基

2、-N-10-甲基碟酸(DAMPA)，DAMPA基本無毒性，且主要通過肝臟代謝，為臨床上使用甲氨蝶呤的患者提供了一條非腎臟通道的排泄途徑，降低大劑量MTX在臨床使用時所面臨的風(fēng)險(xiǎn)。
　　化療是腫瘤治療的重要手段，提高化療藥物的劑量和暴露時間能夠提高化療藥物的療效，但同時化療藥物的毒副作用也隨之提高。CPG2能夠很好的降解MTX，減輕其毒副作用，但是CPG2降解MTX后會影響其抗腫瘤作用。如果能確定CPG2的一個合適的給藥時間點(diǎn)和給藥

3、劑量，使MTX能最大程度的發(fā)揮抗腫瘤作用，同時又不會產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，這樣就能夠給予高劑量的MTX，提高M(jìn)TX的抗腫瘤療效，又能減輕MTX的毒副作用，故本研究的目的是觀察CPG2在體內(nèi)外對MTX抗腫瘤作用的影響，以確定CPG2的合理給藥劑量和給藥時間，使CPG2給藥后即能有效降低MTX的毒性，又盡可能小的影響MTX的抗腫瘤效應(yīng)，為兩藥在臨床上的聯(lián)合使用提供參考。
　　在體外實(shí)驗(yàn)中，用MTT法，觀察CPG2在體外對MTX抑制人乳腺

4、癌MCF-7細(xì)胞和人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞作用的影響。在動物實(shí)驗(yàn)中，用未荷瘤的正常小鼠和裸鼠，觀察了CPG2對500 mg/kg或800 mg/kg劑量下的MTX所致毒性的影響。用小鼠肉瘤S180和人乳腺癌MCF-7移植瘤模型，觀察了CPG2對大劑量MTX(HDMTX)抗腫瘤活性和所致毒性的影響?？鼓[瘤效應(yīng)指標(biāo)包括最大抑制率、瘤重抑制率、瘤體積抑制率和腫瘤分布圖等;MTX毒性觀察指標(biāo)主要包括動物存活數(shù)量、體重變化、血清肌酐和尿素氮以及病

5、理切片等。
　　體外實(shí)驗(yàn)觀察到，0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml濃度的MTX作用2h后，對MCF-7和JEG-3細(xì)胞均具有良好的抑制作用，呈現(xiàn)濃度依賴性。隨著作用時間的延長，低劑量的MTX也顯示出較強(qiáng)的抑制作用。MTX暴露2小時后，加入終濃度為0.01、0.1、1、25、50和100 U/ml的CPG2，MTX對MCF-7細(xì)胞的增生仍具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，呈現(xiàn)出良好的濃度依賴性，與MTX

6、單獨(dú)作用2h的效果相似，提示MTX作用于受試細(xì)胞2小時后，給予CPG2不能消除MTX已經(jīng)產(chǎn)生的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，但是能阻值MTX的進(jìn)一步作用;CPG2的劑量效應(yīng)關(guān)系不明顯，0.01和100 U/ml產(chǎn)生的效果相似，說明CPG2降解MTX活性較強(qiáng)。
　　在毒性試驗(yàn)中，觀察到，對KM小鼠，500 mg/kgMTX組，有4只死亡，體重最低值出現(xiàn)在給藥后第7天，從第8天開始動物體重逐漸恢復(fù);MTX+24hCPG2組有1只動物死亡，體重最低值出

7、現(xiàn)在給藥后第5天，從第6天開始動物體重逐漸恢復(fù);MTX+12hCPG2組未出現(xiàn)動物死亡，動物體重基本沒有下降。對裸鼠，800mg/kgMTX組有3只動物死亡，藥后第7天體重開始恢復(fù)，但恢復(fù)較慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時仍未完全恢復(fù)至給藥前，MTX+12hCPG2組未出現(xiàn)裸鼠死亡，體重下降幅度較小，給藥后3天開始恢復(fù)，給藥后7天體重基本恢復(fù)至給藥前，MTX+16hCPG2組有1只動物死亡，藥后第5天裸鼠體重開始恢復(fù)，藥后第8天體重基本恢復(fù)至給藥前。

8、r>　　對于S180移植瘤模型，第一次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，500 mg/kgMTX組的瘤重抑制率為58.5％，MTX給藥后16h，給予400 U/kgCPG2后瘤重抑制率下降到44.0％，給予100 U/kgCPG2后瘤重抑制率為59.0％，與單用MTX類似。MTX組有4只小鼠死亡，小鼠體重下降較多，給予CPG2后，未出現(xiàn)動物死亡，給予CPG2劑量越大體重下降幅度越小，恢復(fù)也較快。重復(fù)實(shí)驗(yàn)也顯示出類似結(jié)果，
　　對人乳腺癌MCF-7移植瘤實(shí)

9、驗(yàn)，800 mg/kgMTX組的瘤重抑制率為32.4％，有4只動物死亡;MTX給藥后12h，給予200 U/kgCPG2，對瘤重抑制率影響較小，但仍有1只動物死亡;給予100 U/kgCPG2后，瘤重抑制率37.6％，未出現(xiàn)動物死亡;給予50 U/kgCPG2后，瘤重抑制率為45.5％，有1只動物死亡。給予不同劑量的CPG2后，裸鼠體重也出現(xiàn)一定的下降，但下降幅度較單用MTX組低，且恢復(fù)的速度也較快。
　　每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時測量各組小

10、鼠的血清肌酐和尿素氮，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使給予500-800mg/kg的MTX，小鼠未出現(xiàn)因使用HDMTX所引起的腎臟損傷，各組小鼠的血清肌酐和尿素氮并沒有出現(xiàn)明顯的變化，與未給予MTX的小鼠比較，沒有出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。腎臟病理切片也未發(fā)現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化。提示，給予HDMTX后，在小鼠體內(nèi)出現(xiàn)HDMTX所致毒性機(jī)率較低。
　　以上實(shí)驗(yàn)可以得出:在體外，MTX暴露2小時（含以上）可以對受試腫瘤細(xì)胞的生長有較強(qiáng)的抑制效應(yīng);CPG2能夠消除