膠原受體DDR2在頭頸部鱗癌中的作用研究.pdf

1、頭頸部鱗狀細胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)在全世界范圍內(nèi)每年約有500萬病例被確診,約占全部腫瘤病例的6％。在過去的20年里,隨著診斷、外科手術(shù)、放射治療和化學藥物治療技術(shù)水平的提高以及治療方案的成熟,頭頸部鱗癌患者的死亡率已有所降低,但其5年生存率仍僅有40%-50%。術(shù)后高復發(fā)率及高轉(zhuǎn)移率是影響頭頸部鱗癌患者生存率最主要的兩個因素。因此,研究頭頸部鱗癌轉(zhuǎn)移中相關(guān)的信號

2、轉(zhuǎn)導通路將有助于提高對本病的治療。
　　DDR2(Discoidin domain receptor2)是一種受體酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase, RTK),可以被多種膠原激活(I-III型)。DDR2特異性的參與一系列腫瘤生物學行為,包括調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子的表達、腫瘤血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是DDR2通路中一組主要的

3、下游靶基因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)在頭頸部鱗癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,它主要通過促進原發(fā)性腫瘤細胞發(fā)生形態(tài)學改變,減弱細胞與細胞間連接,從而有助于細胞穿透各種屏障而加速腫瘤的侵襲和遷移,而 DDR2是一種調(diào)控 EMT的關(guān)鍵性因素。因此我們推測 DDR2可能是一個新的癌基因。至今為止有關(guān) DDR2在頭頸部鱗癌中相關(guān)功能的研究未見明確報道,本研究目的與意義是探討DDR2基因在頭頸部鱗癌發(fā)病機制中的作用,確定 DDR2基因的功能,為頭頸部鱗癌的防

4、治提供理論依據(jù)。
　　為了明確 DDR2在頭頸部鱗癌中的作用,我們首先檢測了DDR2在頭頸部鱗癌及癌旁組織標本中的表達。qPCR結(jié)果顯示癌組織標本中 DDR2的mRNA表達量明顯高于其對應(yīng)的癌旁正常組織,并隨著腫瘤等級的升高而升高。通過免疫組化及免疫印跡技術(shù),我們觀察到了相同的結(jié)果。在免疫組化結(jié)果中,DDR2表達陽性率及表達強度與患者腫瘤等級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),與患者年齡和性別無關(guān)。上述結(jié)果強烈提示我們在頭頸部鱗癌中,DDR2可能是

5、一種高等級及高轉(zhuǎn)移鱗癌的標記物。
　　臨床證據(jù)顯示高等級 HNSCC在獲得高轉(zhuǎn)移潛能時往往伴隨著 E-cadherin的表達喪失及 vimentin的表達上升。因此,我們選取四種 HNSCC細胞系 Tca8113、TB cells、SCC25和FaDu,同時運用qPCR及免疫印跡技術(shù)檢測其E-cadherin和vimentin的表達,結(jié)果顯示相對于 Tca8113及 TB細胞,SCC25和FaDu細胞高表達 E-cadherin,

6、而 vimentin幾乎不表達。這與上述細胞之前的報道相吻合,提示Tca8113及 TB細胞具有高轉(zhuǎn)移特性,而 SCC25和FaDu細胞則傾向于上皮樣細胞。與此同時,DDR2表達水平檢測結(jié)果顯示其在 Tca8113及 TB細胞中明顯高于SCC25和FaDu細胞,提示 DDR2與 HNSCC細胞的轉(zhuǎn)移潛能具有直接相關(guān)性。
　　為了全面理解 DDR2在 HNSCC細胞系生物學行為中的作用,我們通過外源性腺病毒過表達 DDR2來觀測其對

7、細胞增殖、侵襲和遷移的影響。MTT細胞生長曲線、EdU測細胞增殖及細胞周期結(jié)果均顯示無明顯差別。Transwell及劃痕實驗結(jié)果顯示過表達 DDR2明顯促進了HNSCC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,并且在細胞予以 I型膠原幾次后,這種作用被明顯放大。鑒于細胞侵襲實驗主要依靠 MMP2和MMP9的分泌水平,我們運用免疫印跡檢測兩者的表達水平,結(jié)果顯示過表達 DDR2顯著提高了MMP2和MMP9的表達水平。同時,我們通過小干擾 RNA技術(shù)沉默DDR2在

8、高表達內(nèi)源性 DDR2的TB細胞中重復上述實驗,結(jié)果顯示,DDR2沉默后明顯降低了TB細胞的侵襲和遷移力。通過上述結(jié)果,我們可以假設(shè) DDR2在HNSCC細胞中的生物學功能主要為促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　在腫瘤發(fā)展過程中,EMT主要參與腫瘤細胞局部侵襲、擴散和轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)顯示 DDR2是一種間充質(zhì)細胞標記物以及 EMT的關(guān)鍵性調(diào)控因子。這些確定的理論促使我們?nèi)ゴ_認 DDR2是否參與了HNSCC細胞的EMT轉(zhuǎn)變。細胞鏡

9、下觀察結(jié)果顯示與對照組相比,過表達 DDR2對細胞形態(tài)無明顯改變,同時免疫熒光及免疫印跡結(jié)果顯示過表達 DDR2對 EMT標記性蛋白質(zhì) E-cadherin和vimentin的表達無明顯改變。在體內(nèi)環(huán)境中,缺氧是觸發(fā)腫瘤細胞發(fā)生 EMT轉(zhuǎn)變及轉(zhuǎn)移的一種重要因素,因此我們接下來檢測了在缺氧環(huán)境下 DDR2是否參與了HNSCC細胞的EMT轉(zhuǎn)變。細胞鏡下觀察結(jié)果顯示過表達 DDR2明顯提高了HNSCC細胞的EMT轉(zhuǎn)變,免疫熒光及免疫印跡結(jié)果顯

10、示過表達 DDR2組細胞E-cadherin表達水平明顯降低,同時伴隨著 vimentin表達水平的明顯升高。通過上述結(jié)果,我們推測在 HNSCC細胞中,DDR2參與 EMT的轉(zhuǎn)變可能部分的需要缺氧因素的介入。
　　DDR2對 HNSCC細胞生物學行為的體外調(diào)控作用在體內(nèi)是否與其一致呢?接下來的實驗,我們運用裸鼠皮下荷瘤及尾靜脈注瘤肺部轉(zhuǎn)移模型來驗證這個疑問。結(jié)果顯示過表達 DDR2對腫瘤瘤體形成及腫瘤生長均無明顯作用。肺是腫瘤細

11、胞經(jīng)尾靜脈注射后首先接觸的毛細血管床,因此我們檢測了DDR2在 HNSCC細胞肺轉(zhuǎn)移中的作用。肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)觀察及統(tǒng)計以及肺組織切片 HE染色結(jié)果顯示過表達 DDR2明顯促進了HNSCC細胞肺轉(zhuǎn)移進程。同時肺組織轉(zhuǎn)移瘤免疫組化結(jié)果顯示過表達 DDR2顯著提高了MMP2和MMP9的表達水平。上述結(jié)果提示DDR2在 HNSCC細胞肺轉(zhuǎn)移進程中發(fā)揮重要作用。
　　綜上所述,我們首次發(fā)現(xiàn)了在 HNSCC中,DDR2作為一種促癌基因促進了癌