DDR2在腫瘤低氧適應(yīng)中的作用研究.pdf

1、DDR2（DiscoidinDomainReceptor2）是一種廣泛分布高度保守的受體型酪氨酸激酶，是其配體為天然纖維性膠原（I～I(xiàn)II型）。DDR2主要表達(dá)于胚胎、腦組織、以及延展性強(qiáng)易增生的組織器官如肝臟、皮膚、連接組織等，目前關(guān)于DDR2在腫瘤中表達(dá)的確切報(bào)道僅限于肺癌、鼻咽癌和卵巢癌等幾種。由于DDR2的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞中MMPs的合成與分泌，因此我們認(rèn)為腫瘤組織中可能存在這樣的病理過程：腫瘤的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程中伴隨著諸如炎癥

2、、低氧等微環(huán)境的異常改變，在這些異常改變的影響下腫瘤細(xì)胞中DDR2的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)實(shí)體瘤內(nèi)部豐富的間質(zhì)膠原成以及瘤體結(jié)構(gòu)的紊亂為DDR2提供了與其配體相互作用的生理基礎(chǔ)，使DDR2能夠發(fā)生持續(xù)活化，進(jìn)而通過過分泌MMPs以及其它方式推進(jìn)腫瘤進(jìn)程。沿著這條思路，我們對(duì)DDR2在腫瘤中的作用進(jìn)行了初步的研究。
　　我們通過免疫組織化學(xué)的方法觀察到，乳腺癌病人的組織標(biāo)本中，DDR2表達(dá)陽(yáng)性，且明顯高于乳腺組織良性病變標(biāo)本。定量PCR和免

3、疫印跡方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，DDR2的mRNA和蛋白水平在乳腺癌組織中均顯著高于癌旁組織。然而當(dāng)我們對(duì)多個(gè)乳腺癌細(xì)胞系的DDR2水平檢測(cè)后卻發(fā)現(xiàn)，相比腫瘤組織中DDR2的高表達(dá)，細(xì)胞系中DDR2水平?jīng)]有顯著增高。這種同一分子在細(xì)胞系中與組織中表達(dá)不相一致的現(xiàn)象提示我們：DDR2表達(dá)水平的變化可能與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。
　　ShyuKG等發(fā)現(xiàn)，氧分壓的改變能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞中DDR2的表達(dá)增高。而低氧狀態(tài)是實(shí)質(zhì)性腫瘤微環(huán)境基本

4、特征之一，同時(shí)也是推動(dòng)腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。我們推測(cè)，DDR2的水平可能在腫瘤低氧微環(huán)境下應(yīng)激高調(diào)進(jìn)而發(fā)揮功能。為了驗(yàn)證上述推測(cè)，我們首先給予包括乳腺癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞系低氧及其模擬類似物（CoCl2）刺激，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低氧刺激可呈時(shí)間依賴性上調(diào)腫瘤細(xì)胞中DDR2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并且這一變化趨勢(shì)在上皮細(xì)胞中尤為明顯。這表明腫瘤內(nèi)部的低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)DDR2表達(dá)增高，低氧與DDR2的表達(dá)水平之間存在一定的正相

5、關(guān)性。由于之前Barker等人就有報(bào)道，DDR家族另一成員DDR1在乳腺癌中可見高表達(dá)，因此我們?cè)趯?duì)DDR2與低氧微環(huán)境關(guān)系進(jìn)行研究的同時(shí)，也觀察了DDR1在低氧條件下的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDR1并不存在這種低氧誘導(dǎo)特性。這也提示DDR家族的兩個(gè)成員在腫瘤進(jìn)程中可能通過完全不同的機(jī)制發(fā)揮各自的作用。
　　DDR2作為蛋白酪氨酸激酶受體，發(fā)生磷酸化是其進(jìn)一步發(fā)揮功能的基礎(chǔ)，因此我們?cè)谧C實(shí)了DDR2表達(dá)水平受低氧誘導(dǎo)這一事實(shí)的基礎(chǔ)上，想進(jìn)

6、一步明確DDR2的活性是否也受到低氧的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知，DDR2在其天然配體膠原不存在的情況下，低氧前后磷酸化水平未見明顯差異；而當(dāng)膠原配體存在時(shí)，低氧后可見DDR2的磷酸化水平顯著增加，并可保持這種活化狀態(tài)至少48h以上。一方面，這意味著在腫瘤微環(huán)境中，低氧僅能誘導(dǎo)DDR2的表達(dá)發(fā)生改變，而與其活化并沒有直接關(guān)系。另一方面，這一現(xiàn)象也強(qiáng)烈提示，由于腫瘤間質(zhì)中存在著大量的膠原成分，能夠?yàn)榈脱鯒l件下高表達(dá)的DDR2提供足夠豐富的配

7、體以及與配體相互作用的空間可能，從而使具有慢開慢關(guān)且活化強(qiáng)度不高等特性的DDR2在低氧誘導(dǎo)的短時(shí)高表達(dá)之后能發(fā)生時(shí)間更長(zhǎng)、相對(duì)強(qiáng)度更大的持續(xù)活化效應(yīng)。
　　在明確了DDR2具有腫瘤低氧誘導(dǎo)特性這一事實(shí)后，這種改變所導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制就這成為我們下一步關(guān)注的焦點(diǎn)。為有利于深入探討DDR2低氧誘導(dǎo)的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)DDR2的siRNA，并制備相關(guān)慢病毒。目前關(guān)于DDR2的研究表明，促進(jìn)細(xì)胞增殖以及MMPs的表達(dá)分泌并影響細(xì)胞的

8、運(yùn)動(dòng)能力是DDR2最主要的功能。MTT結(jié)果顯示，常氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)源DDR2即存在促細(xì)胞增殖的作用，低氧條件下DDR2表達(dá)水平增高，其促增殖作用更強(qiáng)。此外，在低氧誘導(dǎo)的DDR2影響下，乳腺癌細(xì)胞的侵襲力和轉(zhuǎn)移力顯著增強(qiáng)?；|(zhì)金屬蛋白酶活性分析結(jié)果則進(jìn)一步說明，低氧條件下腫瘤細(xì)胞這種依賴于DDR2表達(dá)增高而發(fā)生的運(yùn)動(dòng)特性改變與促進(jìn)ECM降解的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2活性增強(qiáng)密切相關(guān)。由此可見，DDR2在腫瘤組織低氧微環(huán)境下高表達(dá)并持續(xù)活化后

9、，通過介導(dǎo)細(xì)胞分泌MMP-2，降解細(xì)胞間質(zhì)ECM，以增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是惡性實(shí)體瘤中細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要途徑，在多種腫瘤的原發(fā)性浸潤(rùn)和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中都起著舉足輕重的作用，是上皮細(xì)胞惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的基礎(chǔ)。Cannito等人的研究證明，低氧能夠通過誘發(fā)EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。那么

10、，低氧誘導(dǎo)DDR2并引發(fā)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的改變是否與腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程有所關(guān)聯(lián)？基于這個(gè)疑問，我們通過形態(tài)學(xué)觀察和標(biāo)志性分子檢測(cè)等方法分析了低氧條件下腫瘤細(xì)胞的改變。結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468隨著給予低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞間緊密連接逐漸消失，細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的極性特征，上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物E-cadherin等的水平降低，伴隨間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin水平增高，細(xì)胞發(fā)生EMT改變。而在通過siRNA方

11、法抑制細(xì)胞DDR2表達(dá)并給予低氧刺激后，細(xì)胞EMT改變的形態(tài)學(xué)與分子學(xué)標(biāo)志均受到明顯抑制。結(jié)合前面關(guān)于DDR2能夠促進(jìn)低氧刺激下細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與侵襲能力增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為活化的DDR2參與了低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT改變。
　　通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，這種低氧誘導(dǎo)的EMT過程依賴于DDR2對(duì)轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail及鈣粘蛋白E-cadherin的調(diào)控。在對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行低氧處理并維持膠原刺激后發(fā)現(xiàn)，維持上皮細(xì)胞特性的重要分子E-cadher

12、in的表達(dá)受到抑制；而在低氧與膠原刺激的基礎(chǔ)上，對(duì)DDR2進(jìn)行基因沉默后，E-cadherin的表達(dá)抑制解除。報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果也顯示，活化型DDR2對(duì)E-cadherin啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性有顯著的抑制作用，而且這一轉(zhuǎn)錄抑制作用是通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail的活性而完成的。此外，我們的結(jié)果還顯示，作為直接參與下調(diào)E-cadherin的最重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail，其表達(dá)也與DDR2的水平呈正相關(guān)。
　　綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)DDR