Rap1在大鼠睪丸發(fā)育中的表達以及在生精細胞凋亡中的研究.pdf

1、目的
　　Rap1是一種在真核生物廣泛表達的GTP結(jié)合蛋白，參與著體內(nèi)多種生物學活動。不同于其它GTP結(jié)合蛋白的是其在人胚腎以及部分腫瘤細胞中可被誘導入核。在之前研究中我們已經(jīng)證實其在不育男性生精細胞中表達升高。推測其可能參與調(diào)節(jié)生精細胞的增殖和分化，調(diào)控精子的發(fā)生，為進一步明確Rap1在生精過程中的作用，我們研究了其在大鼠睪丸發(fā)育以及生精細胞凋亡模型中的表達，對其可能的作用機制進行了探討。
　　方法
　　1.使用不同

2、固定試劑固定大鼠生精細胞各發(fā)育階段（1，7，15，24，37，50和90天）的睪丸組織，進行免疫組織化學染色，了解Rap1在發(fā)育中的表達規(guī)律并分析固定試劑對其表達的影響。結(jié)合使用蛋白質(zhì)免疫印跡研究Rap1在總體睪丸的表達水平。
　　2.使用單劑量MAA(650mg/kg)腹腔注射建立大鼠精母細胞凋亡模型，采用免疫組織化學、TUNEL、蛋白質(zhì)免疫印跡雜交研究Rap1在生精細胞凋亡過程中表達的變化，并使用間接免疫熒光、免疫共沉淀研究R

3、ap1與NF-κB的相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果
　　1.在Bouin’s液固定的大鼠睪丸組織中，P1和P7生精細胞有Rap1表達，從P15開始，Rap1表達于精母細胞核旁的高爾基體，隨著大鼠繼續(xù)發(fā)育，Rap1在高爾基體表達逐漸增強，并在成年后大鼠精母及圓形精子細胞核旁出現(xiàn)Rap1表達。Rap1表達隨著粗線期精母細胞高爾基體的增大而增高。
　　2.在多聚甲醛固定的大鼠睪丸組織中，P1生殖母細胞和P7精原細胞的胞核強表達Ra

4、p1，而P7每個生精小管的陽性細胞數(shù)顯著低于P1(P<0.001)。Rap1在P15大鼠生精小管內(nèi)主要表達于精原細胞胞漿。在P24、P37、P50表達在晚粗線期精母細胞核內(nèi)。在P90大鼠睪丸中，Rap1在各種細胞無顯著著色區(qū)域。在睪丸除生精細胞以外的其它細胞未發(fā)現(xiàn)Rap1表達。
　　3.在睪丸組織蛋白免疫印跡研究中，Rap1在P1仔鼠睪丸組織裂解物中的表達顯著高于P7(P<0.01)。其它各時間點表達無顯著差異。
　　4.在

5、MAA腹腔注射6h大鼠睪丸中，Rap1、NF-κB以及TUNEL染色陽性的粗線期精母細胞在VIII-XIV期小管內(nèi)開始出現(xiàn)，到12h及24h陽性細胞數(shù)明顯增多。睪丸組織蛋白免疫印跡研究提示，各處理組與對照組間睪丸Rap1及NF-κB的表達量無顯著差異。
　　5.Rap1間接免疫熒光加TUNEL染色提示：MAA處理后，各時間點在VIII-XIV期生精小管可見Rap1與TUNEL細胞核內(nèi)共定位的細胞百分比分別為19.1％、57.7％、

6、67.4％，各處理組Rap1+TUNEL陽性細胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.01)。
　　6.Rap1和NF-κB雙標記間接免疫熒光提示在實驗組，兩種蛋白在VIII-XIV期粗線期精母細胞核內(nèi)共定位細胞百分率分別為75.6％、91.8％、94.6％，高于RAP1與TUNEL共表達的百分比。對MAA處理24h及對照大鼠睪丸蛋白進行NF-κB與Rap1免疫共沉淀分析提示，MAA處理組NF-κB結(jié)合的蛋白中Rap1的表達明顯強于對照組。<