MIWI蛋白在小鼠睪丸發(fā)育過(guò)程中的研究.pdf

1、生物通過(guò)生殖實(shí)現(xiàn)親代與后代個(gè)體之間生命的延續(xù)。在雄性哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程中，精子發(fā)生是個(gè)高度協(xié)調(diào)的過(guò)程。精子發(fā)生被分為三個(gè)階段：第一階段是生殖干細(xì)胞起始的有絲分裂過(guò)程，其通過(guò)有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)榫?xì)胞最終成為精母細(xì)胞。第二階段是精母細(xì)胞通過(guò)減數(shù)分裂轉(zhuǎn)變?yōu)榫蛹?xì)胞，導(dǎo)致了單倍體圓形精子細(xì)胞的產(chǎn)生。第三個(gè)階段是圓形精子細(xì)胞經(jīng)過(guò)形態(tài)轉(zhuǎn)變而成為精子。目前研究認(rèn)為，成熟的精子不再有轉(zhuǎn)錄發(fā)生，因此與精子發(fā)生有關(guān)的基因在精子發(fā)生的早期階段即開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。但這些

2、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并未立即翻譯形成蛋白產(chǎn)物，而是呈抑制狀態(tài)達(dá)數(shù)天，直到精子發(fā)生需要時(shí)才進(jìn)行翻譯。在由精原細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炀拥穆L(zhǎng)過(guò)程中有很多RNA和蛋白小分子物質(zhì)的參與，是一個(gè)精確和可調(diào)控的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中所涉及的MIWI蛋白便是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的作用于該過(guò)程的小分子物質(zhì)。
　　 MIWI蛋白是Argonaute蛋白家族的重要成員之一。Argonaute蛋白家族是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的核心元件，在RNA干擾（RNAi）中發(fā)揮重

3、要作用。當(dāng)小RNA與具有同源序列的靶mRNA或靶DNA結(jié)合后，Argonaute家族蛋白識(shí)別部分或者全部的核酸靶標(biāo)，借以來(lái)調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性、蛋白的合成和基因組的結(jié)構(gòu)。Argonaute蛋白主要包括Ago和PIWI兩個(gè)亞家族。其中的PIWI亞家族主要有3個(gè)成員，分別是MIWI，MILI和MIWI2，是生殖系細(xì)胞中的特異性蛋白，與精子的發(fā)生有非常密切的關(guān)系，敲除Miwi，Mili或Miwi2基因，都會(huì)造成小鼠精子產(chǎn)生明顯缺陷，表現(xiàn)為雄性

4、不育。此亞家族與生殖細(xì)胞特異性事件相關(guān)，并且特異性分布于生殖細(xì)胞中，其表達(dá)與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)。小鼠中的MIWI蛋白是這個(gè)亞家族的代表。正是由于生殖細(xì)胞表達(dá)集中的特異性，尤其是哺乳動(dòng)物睪丸表達(dá)的特異性，對(duì)PIWI亞家族蛋白功能的研究主要于精子發(fā)生。
　　 目前的研究表明，在哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞中，PIWI亞家族蛋白通過(guò)與piRNA（piwi-interacting RNA）的結(jié)合形成piRNA復(fù)合物（piRC）來(lái)調(diào)控基因沉默

5、途徑。通過(guò)對(duì)MIWI蛋白的分析研究，有利于我們進(jìn)一步了解生物配子發(fā)生的分子調(diào)控及其機(jī)理，對(duì)理解此蛋白的作用機(jī)制也有重要意義，還可以為不育癥找到新的靶點(diǎn)，從而為臨床治療開(kāi)拓思路及提供理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料：
　　 各年齡段的SPF級(jí)C57BL/6J小鼠睪丸組織；常規(guī)免疫組化試劑盒、MIWI抗體、羊抗兔二抗、鋨酸、2.5％戊二醛、4％多聚甲醛、梯度酒精（70％，80％，90％，95％，100％）、二甲苯、石蠟、蘇木素、中

6、性樹(shù)膠
　　 方法：
　　 1、提取各年齡段小鼠睪丸組織蛋白，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)是否存在MIWI蛋白的表達(dá)；
　　 2、制作小鼠睪丸組織石蠟切片，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，明確MIWI蛋白在細(xì)胞水平的表達(dá)定位；
　　 3、進(jìn)一步采用免疫電鏡技術(shù)，檢測(cè)MIWI蛋白在亞細(xì)胞水平的表達(dá)定位。
　　 結(jié)果：
　　 1.、Western結(jié)果顯示了MIWI蛋白在小鼠發(fā)育的胚胎的各組織中無(wú)表達(dá)，而是存在于成

7、年小鼠睪丸組織中，并在小鼠發(fā)育至6周、8周檢測(cè)到MIWI蛋白的表達(dá)。
　　 2、免疫組化結(jié)果顯示MIWI蛋白在小鼠睪丸發(fā)育的精母細(xì)胞與精子細(xì)胞時(shí)期表達(dá)。
　　 3、亞細(xì)胞定位顯示MIWI蛋白存在于緊貼核膜處，表明其在核質(zhì)運(yùn)輸中可能起到重要作用，是Chromtoid Body的重要組成成分。
　　 討論：
　　 MIWI蛋白在成熟小鼠睪丸中特異性表達(dá)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，MIWI蛋白只在成年小鼠的睪丸中表達(dá)，在

8、胚胎期以及出生后4周內(nèi)小鼠的各組織中均無(wú)表達(dá)。MIWI蛋白的定位顯示了生殖細(xì)胞中特異結(jié)構(gòu)的存在。Chromatoid body（CB，擬染色體）是一個(gè)生殖細(xì)胞特異性的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)中，電鏡結(jié)果顯示CB是由細(xì)絲分支形成的不規(guī)則網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而結(jié)合而成的緊密團(tuán)塊。在很多物種中，細(xì)胞中如果存在CB結(jié)構(gòu)，表明該細(xì)胞為生殖細(xì)胞。目前已知有多種蛋白定位于CB中。在精子細(xì)胞中，CB以平行或是垂直的方式沿核膜快速的移動(dòng)，而且有實(shí)驗(yàn)證明CB移動(dòng)過(guò)程中從核中收

9、集基因產(chǎn)物，參與核質(zhì)間RNA的運(yùn)輸。對(duì)于CB這種生殖細(xì)胞特異結(jié)構(gòu)的形成和功能的分子機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用免疫電鏡技術(shù)在亞細(xì)胞水平定位MIWI蛋白。本實(shí)驗(yàn)中采用了免疫電鏡技術(shù)在精母細(xì)胞中定位MIWI蛋白的表達(dá)，可見(jiàn)MIWI蛋白在精母細(xì)胞后期聚合，并存在于核膜周?chē)?。免疫染色是免疫電鏡技術(shù)中極為重要的一個(gè)步驟，本實(shí)驗(yàn)采用的是包埋前染色。免疫電鏡實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，即要考慮到保存較好的超微結(jié)構(gòu)，又要能很好地體現(xiàn)免疫陽(yáng)性反應(yīng)。包埋前染色后的樣