嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤中多個腫瘤抑制基因異常甲基化的研究.pdf

1、第一部分嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤中多個腫瘤抑制基因DNA甲基化研究
　　 目的:
　　 良惡性嗜鉻細(xì)胞瘤(PHEO)和副神經(jīng)節(jié)瘤(PGL)的鑒別以及惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的有效治療是目前神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤研究中尚未解決的難題。表觀遺傳學(xué)是目前研究腫瘤及疾病發(fā)生中除遺傳學(xué)改變外的另一個重要領(lǐng)域。對嗜鉻細(xì)胞瘤的表觀遺傳學(xué)研究國外才剛剛開始,故本研究選擇與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的基因p16INK4a,DNA修復(fù)相關(guān)的基因hMLH1、MGMT、BR

2、CA1,ras相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑的RASSF1A基因,細(xì)胞凋亡相關(guān)的DcR2基因,基因突變導(dǎo)致嗜鉻細(xì)胞瘤發(fā)生的SDHB、SDHD、VHL基因以及本課題組前期研究中顯示在嗜鉻細(xì)胞瘤中低表達的LRP1B基因用表觀遺傳學(xué)中的甲基化特異性PCR方法(MSP)研究上述基因的甲基化狀態(tài),尋找嗜鉻細(xì)胞瘤CpG島甲基化表型；分析基因甲基化改變與患者腫瘤良惡性及其他臨床特征之間的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.用E.Z.N.ATM DNA/

3、RNA Isolation Kit提取24例PHEO(10例惡性,14例良性)、29例PGL(14例惡性,15例良性)和7例正常腎上腺髓質(zhì)的組織DNA；
　　 2.甲基化特異性PCR方法檢測不同組織中p16INK4a、RASSF1A、DcR2、MGMT、SDHB、SDHD、VHL、LRP1B、BRCA1、hMLH1基因的甲基化狀態(tài),探討PHEO和PGL中上述基因DNA甲基化改變；
　　 3.分析患者基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)

4、與腫瘤良惡性及其他臨床資料的關(guān)系,了解其在PHEO和PGL中的病理生理意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.p16INK4a、RASSF1A、MGMT、DcR2基因在PHEO和PGL中的甲基化改變
　　 1)在53例PHEO/PGL組織中分別檢測到p16INK4、RASSF1A、MGMT、DcR24個基因的甲基化,檢出率為52.8％、52.8％、35.8％、60.4％。在PHEO中4個基因甲基化檢出率分別為58.3％(

5、14/24)、58.3％(14/24)、41.7％(10/24)、54.2％(13/24),其中惡性分別為33.3％(8/24)、25.0％(6/24)、20.8％(5/24)、20.8％(5/24)；在PGL中4個基因甲基化檢出率分別為48.3％(14/29)、48.3％(14/29)、31.0％(9/29)、65.6％(19/29),惡性分別為37.9％(11/29)、34.5％(10/29)、20.7％(6/29)和48.3％(1

6、4/29)；
　　 2) p16INK4基因在良惡性PHEO、良惡性PGL中的甲基化檢出率分別為42.9％(6/14)、80.0％(8/10)、20.0％(3/15)及78.6％(11/14);
　　 3) RASSF1A基因在良惡性PHEO、良惡性PGL中的甲基化檢出率分別為57.1％(8/14)、60.0％(6/10)、26.7％(4/15)及71.4％(10/14);
　　 4) MGMT基因在良惡性PHE

7、O、良惡性PGL中的甲基化檢出率分別為35.7％(5/14)、50.0％(5/10)、20.O％(3/15)及42.9％(6/14);
　　 5) DcR2基因在良惡性PHEO、良惡性PGL中的甲基化檢出率分別為57.14％(8/14)、50.00％(5/10)、33.33％(5/15)及100％(14/14);
　　 6)惡性PHEO和PGL中至少有一個基因發(fā)生甲基化,而在良性腫瘤中有8例標(biāo)
　　 本(1例PH

8、EO,7例PGL)4個基因均未發(fā)生甲基化。CpG島甲基化表型(CIMP)陽性者19例,包括5例惡性PHEO、4例良性PHEO；9例惡性PGL,1例良性PGL。
　　 2.p16INK4a、RASSF1A、MGMT、DcR2基因甲基化的臨床意義
　　 1)惡性PGL患者24h尿去甲腎上腺素(NE)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)水平高于良性患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。
　　 2) PHEO中p16INK

9、4a基因甲基化的患者24h尿腎上腺素(E)高于非甲基化者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.014)。
　　 3) PGL中,p16INK4a基因甲基化多見于惡性患者(vs良性),差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.002),有多見于發(fā)病年齡小的趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.085)。RASSF1A基因甲基化多見于惡性患者(vs良性),差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.016)。DcR2基因甲基化多見于惡性患者、發(fā)病年齡小的患者,差異

10、具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。
　　 4)甲基化指數(shù)(MI)在惡性PGL患者明顯高于良性患者,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.001)。CpG島甲基化表型(CIMP)陽性亦多見于惡性PGL患者,與良性患者相比差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.002)。
　　 3.p16INK4a、RASSF1A、MGMT、DcR2基因甲基化的相關(guān)性分析
　　 1) PHEO中RASSF1A與DcR2基因甲基化具有相關(guān)性(r

11、=0.410,p<0.05)。
　　 2) PGL中p16INK4a與DcR2基因甲基化具有相關(guān)性(r=0.556,p<0.01)；RASSF1A與MGMT、DcR2基因甲基化具有相關(guān)性(r=0.396,p<0.05和r=0.411,p<0.05)。
　　 4.SDHB、SDHD、VHL、LRP1B、BRCA1、hMLH1基因在PHEO和PGL中的甲基化改變
　　 未檢測到該6個基因DNA甲基化改變。
　　

12、 結(jié)論:
　　 1.84.9％(45/53)的PHEO和PGL中至少有p16INK4a、RASSF1A、DcR2、MGMT四個基因中的1個以上發(fā)生啟動子區(qū)甲基化,提示上述腫瘤抑制基因DNA甲基化在PHEO和PGL的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；
　　 2.p16INK4a、RASSF1A、DcR2基因甲基化均與PGL的惡性行為有關(guān),提示p16INK4a、RASSF1A、DcR2基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)可作為鑒別良惡性PGL的實