早孕小鼠子宮內(nèi)膜中Dicer基因的表達(dá)規(guī)律.pdf

1、目的:
　　胚胎著床是一個(gè)復(fù)雜精細(xì)的生命過程，是決定妊娠是否成功的重要環(huán)節(jié)。對(duì)其分子機(jī)制的研究一直是近年來生殖醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)，但目前仍未完全明了。隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA分子在建立母胎對(duì)話，尤其是著床過程中對(duì)子宮容受性及胚泡侵入行為起到了調(diào)控作用。miRNAs在體內(nèi)的成熟需要關(guān)鍵酶核酸內(nèi)切酶Dicer的參與。已知Dicer基因在生物體內(nèi)多種生理或病理事件中都發(fā)揮了重要作用。本實(shí)驗(yàn)將Dicer基因作為研究對(duì)象，將其

2、在早孕小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)作為研究目標(biāo)，以期發(fā)現(xiàn)Dicer基因在妊娠小鼠著床前后的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步探討Dicer基因在胚胎著床過程中的發(fā)揮的作用及分子機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.動(dòng)物模型建立及材料收集:建立未孕、真孕、假孕小鼠模型，收集未孕小鼠、真孕小鼠妊娠1 d～7 d、假孕小鼠妊娠1d～7d各組的子宮內(nèi)膜組織，于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>　　2.總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT FQ-PCR):用Tr

3、izol裂解液裂解子宮內(nèi)膜，提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)Dicer mRNA的序列設(shè)計(jì)出其對(duì)應(yīng)的PCR上下游引物，采用β-actin作為內(nèi)參，檢測各組小鼠子宮內(nèi)膜組織中Dicer mRNA的表達(dá)。
　　3.免疫組織化學(xué):將收集的子宮內(nèi)膜組織處理后進(jìn)行石蠟包埋，普通切片，然后進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，對(duì)各組小鼠子宮內(nèi)膜中Dicer蛋白表達(dá)進(jìn)行定量、定位檢測。
　　4.蛋白提取及Western Blot:用RIPA裂解液提

4、取各組小鼠子宮內(nèi)膜的總蛋白，BCA定量法測定蛋白濃度。用Western印跡法檢測各組小鼠子宮內(nèi)膜中Dicer蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:在真孕組小鼠中，與妊娠1d（記為d1）相比，d4，d5，d6組Dicer mRNA表達(dá)明顯升高，并于d5達(dá)到高峰;假孕組小鼠中，與d1相比，d4，d5，d6，d7四組Dicer mRNA表達(dá)也升高，其趨勢(shì)與真孕組一致。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示:在

5、未孕小鼠的子宮內(nèi)膜中，Dicer在腔上皮、腺上皮和基質(zhì)細(xì)胞中均有少量表達(dá);真孕組小鼠中，小鼠妊娠1d子宮內(nèi)膜基質(zhì)開始出現(xiàn)Dicer的強(qiáng)表達(dá)，到d4、d5子宮內(nèi)膜上皮及基質(zhì)均可見Dicer表達(dá)增強(qiáng)，d5表達(dá)顯著高于d1，且基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)于上皮，一直持續(xù)到d6、d7子宮內(nèi)膜發(fā)生蛻膜化;假孕組小鼠中，d4至d7 Dicer的表達(dá)亦明顯增強(qiáng)，d4、d5主要表達(dá)于基質(zhì)，d6、d7則主要見于上皮。
　　3.Western結(jié)果顯示:在小鼠真孕組

6、中，與d1相比，未孕及d2、d3組Dicer蛋白表達(dá)量沒有明顯改變，d4、d5、d6、d7表達(dá)明顯升高;假孕組的表達(dá)與真孕類似，與d1相比，d4、d5、d6組Dicer蛋白表達(dá)也升高。
　　結(jié)論:
　　1.早孕小鼠妊娠4～6 d子宮內(nèi)膜組織中，Dicer mRNA和蛋白的表達(dá)量與第一天比較，均有顯著升高。
　　2.著床前，Dicer蛋白在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞中均少量表達(dá)，著床窗口期與著床后，Dicer表達(dá)量增加，