早孕小鼠胚胎著床前后子宮內(nèi)膜microRNAs差異表達及miR-106b表達規(guī)律研究.pdf

1、目的：
　　 應用microRNAs（miRNAs）芯片篩選早孕小鼠胚胎著床前后子宮內(nèi)膜差異表達miRNAs，進行實時熒光定量PCR驗證，運用靶基因預測數(shù)據(jù)庫預測差異表達miRNAs調(diào)控的靶基因，為研究其在早孕小鼠胚胎著床過程中的作用打下基礎；通過數(shù)據(jù)庫的篩選，對靶基因指向與胚胎著床子宮內(nèi)膜增殖相關的miR-106b在早孕小鼠胚胎著床前后子宮內(nèi)膜表達規(guī)律進行研究，為研究miR-106b在胚胎著床過程中對子宮內(nèi)膜的作用機制打下基礎

2、。
　　 方法：
　　 1.樣本的準備：分別收集孕4天和孕6天的小鼠子宮內(nèi)膜組織。
　　 2.miRNAs芯片分析：提取小鼠子宮內(nèi)膜組織的總RNA，總RNA用miRCURYTM LNA Array labeling kit（Exiqon，Denmark）使用Cy3按照說明書標記。Cy3標記的RNA用miRCURYTM LNA Arrays（Exiqon，Denmark）進行雜交。通過Gene Pix4000B掃描

3、儀和Gene Pix6.0軟件（Axon Instruments，Union City，CA）進行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析。
　　 3.熒光定量PCR檢測部分差異表達miRNAs：根據(jù)miRNA成熟序列設計特異性的反轉(zhuǎn)錄引物進行反轉(zhuǎn)錄，設計miRNAPCR.上下游引物進行實時熒光定量PCR，采用U6作為內(nèi)參，進行歸一化。
　　 4.生物信息學分析：應用目前常用miRNAs靶基因預測網(wǎng)站Targetscan、Pictar、miR

4、Base來檢索差異表達miRNAs的預測靶基因。
　　 5.原位雜交：原位雜交檢測miR-106b在胚胎著床前后子宮內(nèi)膜的表達量和表達部位。
　　 結(jié)果：
　　 1.miRNAs芯片結(jié)果顯示：孕6天比孕4天上調(diào)2倍及以上的miRNAs有17個；下調(diào)2倍及以上miRNAs有18個。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示芯片數(shù)據(jù)可靠。通過Targetscan、Pictar、miRBase等數(shù)據(jù)庫篩查，初步獲得差異表達的部分miR

5、NAs多指向與增殖、凋亡和抗凋亡相關的靶基因。
　　 2.miRNAs芯片、實時熒光定量PCR和原位雜交顯示：miR-106b在孕4天的表達高于孕6天2倍以上，且主要表達在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞，在腔上皮細胞和腺上皮細胞沒有表達。提示miR-106b可能通過調(diào)控其靶基因而調(diào)控早期妊娠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的生長、增殖、分化和凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究結(jié)果顯示孕6天與孕4天相比，存在差異表達的miRNAs，提示

6、miRNAs可能在胚胎著床前后子宮內(nèi)膜中起重要的調(diào)控作用。
　　 2.利用實時熒光定量PCR.進一步驗證了部分差異表達的miRNAs，對這些miRNAs在孕6天和孕4天子宮內(nèi)膜組織的表達量進行定量檢測，驗證了miRNAs芯片結(jié)果的可靠性。
　　 3.利用生物信息學方法，預測差異表達的miRNAs的靶基因，推測這些miRNAs可能通過調(diào)節(jié)增殖、凋亡和抗凋亡相關的靶基因來調(diào)控胚胎著床。
　　 4.實時熒光定量PCR檢