膀胱癌順鉑耐藥與其基因甲基化相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)了解順鉑耐藥膀胱癌細(xì)胞中DNA甲基化譜的改變,探索與發(fā)生順鉑耐藥密切相關(guān)的基因的甲基化及其蛋白表達(dá)的變化,為闡明膀胱癌化療耐藥機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　(1)順鉑耐藥膀胱癌細(xì)胞株的建立:利用順鉑濃度梯度遞增法(0.2-2.0mg/L),在T24膀胱癌細(xì)胞中建立順鉑耐受的細(xì)胞株亞型(T24/DDP),并對(duì)細(xì)胞的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),包括順鉑敏感性、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞周期等。

2、r>　　(2)順鉑耐藥膀胱癌細(xì)胞DNA甲基化譜分析與耐藥相關(guān)甲基化基因的篩選:DNA甲基化芯片對(duì)T24及T24/DDP細(xì)胞基因組的DNA甲基化譜進(jìn)行分析,并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,篩選高甲基化,及低甲基化修飾基因。利用realtime-PCR方法對(duì)篩選出的具有表達(dá)差異的甲基化修飾基因進(jìn)行分析,并結(jié)合文獻(xiàn)資料,最終采用MSP法,對(duì)篩選出的甲基化修飾基因進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證分析。
　　(3)通過(guò)5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化了解順鉑耐藥膀胱癌細(xì)胞

3、生物學(xué)的作用;并對(duì)細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。
　　(4)采用5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化了解逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥膀胱癌細(xì)胞的分子機(jī)制:利用real time-PCR及western blot方法,對(duì)T24/DDP及經(jīng)5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化處理T24/DDP細(xì)胞中關(guān)鍵基因及其蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　(1)成功建立順鉑耐藥的膀胱癌細(xì)胞(T24/DDP):DDP敏感性實(shí)驗(yàn)表明,在20ug/ml濃度的DDP處理下

4、,T24細(xì)胞死亡率接近100％,而同樣濃度下順鉑耐受的細(xì)胞株亞型T24/DDP細(xì)胞的死亡率則是30%。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明,T24與T24/DDP細(xì)胞的倍增時(shí)間分別為72.5和90.2小時(shí)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察表明,T24與T24/DDP細(xì)胞形態(tài)學(xué)無(wú)明顯差異。細(xì)胞周期分析表明,T24/DDP細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加,G2/M期細(xì)胞下降。
　　(2)順鉑耐藥膀胱癌細(xì)胞DNA甲基化差異基因篩選:利用DNA甲基化譜芯片對(duì)T24及T24/

5、DDP兩個(gè)細(xì)胞系的基因組DNA甲基化譜進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)1120個(gè)甲基化差異位點(diǎn);并篩選出40個(gè)高甲基化,18個(gè)低甲基化修飾基因。然后通過(guò)real time-PCR方法對(duì)該58個(gè)差異甲基化修飾基因的表達(dá)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)其中30個(gè)基因的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)合文獻(xiàn)資料,又篩選出和本研究相關(guān)基因20個(gè),采用MSP法,對(duì)這些基因的甲基化修飾在細(xì)胞水平上又進(jìn)行了驗(yàn)證分析,最終篩選出與甲基化譜芯片結(jié)果一致的15種基因,包括14種高甲基化和1種低甲基化修

6、飾基因。
　　(3)5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化對(duì)順鉑耐藥膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)作用:經(jīng)去甲基化處理后,之前發(fā)現(xiàn)的14種高甲基化修飾差異基因中的7種基因的高甲基化修飾被改變:ABCC6,CCNA1,HPP1,ITGA4,RASSF1A,RUNX3,TMS1。同時(shí)去甲基化處理后,T24/DDP細(xì)胞對(duì)于順鉑的敏感性顯著提高、細(xì)胞凋亡比例增加、S期細(xì)胞比例顯著增加。
　　(4)5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥膀胱癌細(xì)胞的分

7、子機(jī)制研究:利用real time-PCR和western blot方法的分析結(jié)果表明,上述7種基因(ABCC6,CCNA1,HPP1,ITGA4,RASSF1A,RUNX3,TMS1),經(jīng)5-氮雜-2-脫氧核苷去甲基化處理后,其mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著增加。
　　結(jié)論:
　　(1)順鉑濃度梯度遞增法所建立的T24/DDP細(xì)胞株對(duì)順鉑具有很好的耐受性,可以作為體外模型用于順鉑耐藥機(jī)制的研究。
　　(2)膀胱癌細(xì)胞發(fā)