卵巢癌TGFBI啟動子甲基化與卵巢癌耐藥的相關性研究.pdf

1、研究背景：
　　 卵巢癌（上皮性癌）是當前病死率最高的婦科惡性腫瘤之一。近年來卵巢癌的治療有了長足發(fā)展，在滿意的腫瘤細胞減滅術基礎上輔以鉑類和紫杉醇為主的聯(lián)合化療的治療策略雖然改善了初治卵巢癌的預后，但其總體生存率仍無明顯改善，晚期卵巢癌5年生存率仍徘徊在30％左右。究其根源，腫瘤原發(fā)或化療后的獲得性耐藥是治療失敗的主要原因之一。因此，逆轉耐藥對提高患者生存率、改善預后有著重要的臨床意義。
　　 腫瘤的耐藥與多種因素相關

2、，如腫瘤基因的擴增、易位、缺失或突變等，而表觀遺傳學同樣在化療耐藥形成的過程中發(fā)揮著重要作用。作為表觀遺傳的重要機制之一，基因啟動子中CpG島的甲基化是細胞中必不可少的一種修飾方式，是目前最為前沿及研究最多的表觀遺傳學機制。腫瘤細胞中甲基化狀態(tài)的改變可以引起整體甲基化狀態(tài)降低亦或局部甲基化程度增高，進而導致腫瘤細胞對于化療藥物的敏感性。一些相關基因如促藥物外排基因啟動子甲基化程度的降低可誘導耐藥的產生，而由抑癌基因啟動子的過度甲基化所致

3、的基因沉默(genesilencing)則可最終導致耐藥性的產生。
　　 轉化生長因子β誘導基因（transforming growth factor β induced gene，TGFBI），又被稱為βig-H3基因(TGF-βinduce gene，colone3，βig-H3)，最早是在TGF-β刺激的肺腺癌細胞株A549中克隆得到的。作為細胞外基質分子之一的TGFBI，最先被關注的是其調節(jié)細胞粘附和遷移的功能。隨著研究

4、的深入人們發(fā)現(xiàn)，TGFBI在正常細胞或永生化細胞系中表達水平上調，但在許多腫瘤組織中表現(xiàn)為表達水平下降或表達沉默，自此開始了對其作為腫瘤抑制基因的功能研究。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在肺癌和前列腺癌等多種腫瘤中都存在TGFBI的啟動子甲基化狀態(tài)，此外最新的研究顯示，在卵巢癌中也檢測到了TGFBI啟動子區(qū)的高甲基化。目前還未有研究就TGFBI基因啟動子區(qū)的高甲基化狀態(tài)是否與卵巢癌化療耐藥相關進行過探討，鑒于此，本課題擬通過檢測卵巢癌組織及細胞系中T

5、GFBI的甲基化程度及表達水平，對照卵巢癌耐藥細胞系及其對應敏感株中TGFBI甲基化狀態(tài)及表達水平的不同，探討卵巢癌中TGFBI甲基化狀態(tài)與腫瘤耐藥的相關性。
　　 第一部分：TGFBI在上皮性卵巢癌組織中的表達及其甲基化狀態(tài)的檢測
　　 目的:檢測上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中TGFBI啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)及其mRNA、蛋白表達情況，分析TGFBI異常甲基化與其表達的相關性及其與卵巢癌臨床分期、組織分級、病

6、理類型等特征間的關系，初步探討TGFBI啟動子區(qū)甲基化在卵巢癌分子發(fā)病中的作用。
　　 方法:本研究采用RT-PCR及免疫組化方法檢測正常卵巢、良性卵巢腫瘤及卵巢癌組織中TGFBI的表達情況，并通過甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)及亞硫酸氫鹽基因組測序法(Bisufite genomic sequencing，BGS)檢測不同組織中TGFBI啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。
　　 結果

7、:1.在全部正常卵巢及良性卵巢腫瘤組織中均檢測到TGFBImRNA表達，陽性表達率為100％(10/10)，而在卵巢癌組織中TGFBI的表達率明顯下降，僅為30％(12/40)。卵巢癌組織與正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織中TGFBI表達存在顯著差異(x2=3.9474，p＜0.05)。
　　 2.10例正常卵巢組織及10例良性卵巢腫瘤組織中，均檢測到TGFBI蛋白表達，且均呈現(xiàn)強陽性（2+或3+），相反，在40例卵巢癌組織中，T

8、GFBI蛋白表達缺如或呈現(xiàn)低表達（0或1+）。卵巢癌組織中TGFBI蛋白表達水平與正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織間存在顯著的統(tǒng)計學差異（x2=50，p＜0.01）。
　　 3.卵巢癌組織中72.5％(29/40)的組織存在TGFBI甲基化，卵巢良性腫瘤中僅10％(1/10)檢測到TGFBI基因甲基化，而在正常卵巢組織卻沒有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，三組之間差異顯著(x2=24.5，p＜0.01)。
　　 4.TGFBI啟動子區(qū)甲基化陰

9、性的組織其表達率較高，為90.91％(10/11)，而存在啟動子區(qū)甲基化的組織中表達率僅為6.90％(2/29)，其間表達存在顯著性差異(x2=7.8108，p＜0.01)。
　　 5.TGFBI啟動子區(qū)的甲基化程度與這些臨床病理特征均無明顯相關性，但隨著手術病理分期的進展以及組織病理學分級的增高，TGFBI的甲基化程度有明顯升高的趨勢。
　　 結論:TGFBI在上皮性卵巢癌組織中低表達或表達缺失。TGFBI啟動子區(qū)Cp

10、G島的高甲基化是上皮性卵巢癌中的頻發(fā)事件，它是卵巢癌中TGFBI低表達或表達缺失的重要原因，在卵巢癌的發(fā)生過發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。TGFBI的高甲基化可作為表觀遺傳學標記物。
　　 第二部分：TGFBI啟動子區(qū)甲基化與卵巢癌化療耐藥的相關性研究
　　 目的:擬通過MSP及BGS方法聯(lián)合檢測卵巢癌紫杉醇敏感株及耐藥株中TGFBI啟動子區(qū)甲基化水平，應用去甲基化試劑5-aza-dc作用于細胞系，分析去甲基化作用前后TGFBI

11、表達水平的改變，以及對細胞增殖的影響，初步分析TGFBI甲基化狀態(tài)與上皮性卵巢癌化療耐藥的相關性，討論卵巢癌耐藥的可能機制及其治療策略。
　　 方法:本研究采用實時熒光定量PCR及Western Blotting方法檢測去甲基化藥物作用前后TGFBI表達;MSP及BGS法聯(lián)合檢測6種上皮性卵巢癌細胞系中TGFBI啟動子區(qū)甲基化狀態(tài);MTT法檢測去甲基化藥物作用前后的細胞增殖及遷移能力的改變。
　　 結果:1.紫杉醇耐藥株

12、SKOV3/TR和A2780/TR表現(xiàn)為完全甲基化狀態(tài)(M)，其余細胞株則表現(xiàn)為混合甲基化狀態(tài)(M+U)。敏感株與對應耐藥株間的甲基化率檢測差異顯著，具有統(tǒng)計學意義，SKOV3/TR(94.3％)與SKOV3(42.9％)(x2=64.43,p＜0.01),A2780/TR(91.4％)及A2780(35.2％)(x2=71.38,p＜0.01)。
　　 2.紫杉醇耐藥細胞株中TGFBI呈完全甲基化狀態(tài)，去甲基化藥物可以使其部分

13、至全部去甲基化。去甲基化藥物作用后TGFBI在紫杉醇耐藥細胞中表達顯著增高，SKOV3/TR（7.8±0.9vs.0，P＜0.001）以及A2780/TR(6.4±0.2vs.0，P＜0.001);而在其它細胞系中用藥后雖有表達升高，但無顯著差異。WesternBlotting方法對兩對敏感株及耐藥株用藥前后的TGFBI蛋白表達進行了檢測，結果與其mRNA表達相吻合。
　　 3.10mmol/L5-aza-dc處理96h后，紫杉

14、醇耐藥株SKOV3/TR及A2780不同濃度紫杉醇(0.01、0.1、1、10μM)處理下的抑制率均高于對照組細胞，差異有統(tǒng)計學意義，SKOV3/TR(0.19±0.01μMvs.0.42±0.02μM，P=0.001)及A2780(0.012±0.0001μMvs.0.33±0.011μM，P=0.001)的IC50值均較對照組有顯著差異。
　　 結論:卵巢癌細胞系中均檢測出TGFBI啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，應用去甲基化藥物5-a