CD137L在急性髓細胞白血病中的突變表達及臨床意義研究.pdf

1、摘 要目的：人C D l 3 7 L 是存在于細胞膜表面的I I 型跨膜蛋白，通過傳導共刺激信號來發(fā)揮作用，在動物實驗中表明可以增強T 細胞所介導的抗腫瘤生物活性。本實驗檢測C D l 3 7 L 在急性髓細胞白血病細胞系及臨床患者中的突變表達，為臨床急性髓細胞白血病的診斷和治療提供依據(jù)。并構(gòu)建和表達人C D l 3 7 L 胞外區(qū)蛋白，為治療C D l 3 7 L突變疾病奠定基礎(chǔ)。方法：設(shè)計引物建立s C D l 3 7 L 突變檢測

2、方法，采用R T —P C R 檢測T H P - 1 細胞C D l 3 7 L的表達；收集臨床A M L 病例，經(jīng)F i c o l l 分離后得到單個核細胞，定性檢測臨床患者s C D l 3 7 基因突變。用基因克隆將人C D l 3 7 L 胞外區(qū)基因，組裝到P E T 3 0 ( a ) 表達載體中；親和層析進行純化，S D S —P A G E 和W e s t e r nb l o t 分析蛋白表達情況。E L I S

3、A 和免疫組化初步檢測C D l 3 7 L 的結(jié)合活性。結(jié)果：在T H P 一1 細胞檢測到兩種s C D l 3 7 L 的突變類型，命名為m l 和m 2 。m 1 型突變在A M L 患者發(fā)生率較低；m 2 型突變發(fā)生率依下列次序遞減：M 2 > M I = M 6 > M 4 > M 5 > M 3 ；m 2 型突變與A M L 疾病進展密切相關(guān)( P < O ．0 5 ～O ．0 1 ) 。構(gòu)建

4、、表達并獲得了純度較高、產(chǎn)量較大的C D l 3 7 L 可溶性蛋白，產(chǎn)量大1 2 m g ／L 培養(yǎng)基。該蛋白能與C D l 3 7 陽性的細胞結(jié)合。結(jié)論：s C D l 3 7 L 變化與A M L 疾病發(fā)展和發(fā)生類型相關(guān)，開展臨床檢測s C D l 3 7 L 有助于監(jiān)控A M L 的治療和預后判斷。獲得的人C D l 3 7 L 胞外區(qū)蛋白，在抗腫瘤的免疫治療中具有潛在應用前景。碩士研究生： 宋敏( 病理生理學)指導老師： 徐珞

5、教授關(guān)鍵詞：C D l 3 7 L ； A M L ；突變；共刺激分子；原核表達目錄弓l 言?????????????????????????????????1第一章C D l 3 7 L 在急性髓細胞白血病中的突變表達及臨床意義????????3一、實驗材料和方法??????????????????????????31 ．主要試劑??????????????????????????????32 ．實驗儀器???????????????

6、???????????????33 ．細胞培養(yǎng)??????????????????????????????34 ．R T —P C R ???????????????????????????????55 ．D N A 片段的回收???????????????????????????66 ．D N A M A N 測序結(jié)果分析????????????????????????67 ．W e s t e r n B l o t 分析?????

7、????????????????????78 ．臨床資料??????????????????????????????89 ．統(tǒng)計學分析?????????????????????????????8二、實驗結(jié)果?????????????????????????????91 ．T H P 一1 細胞s C D l 3 7 L 表達???????????????????????92 ．蛋白水平鑒定s C D l 3 7 L 的表達???????

8、?????????????1 03 ．定性檢測s C D l 3 7 L 剪接突變?????????????????????1 14 ．s C D l 3 7 L 表達形式在A M L 患者亞型中的分布??????????????1 15 ．s C D l 3 7 L 表達形式與A M L 患者疾病進展關(guān)系??????????????1 2三、d 、結(jié)??????????????????????????????1 3第二章人C D l

9、3 7 L 胞外區(qū)基因的克隆及表達???????????????1 4一、實驗材料和方法?????????????????????????1 41 ．主要試劑?????????????????????????????1 42 ．實驗方法?????????????????????????????1 4二、實驗結(jié)果????????????????????????????1 81 ．C D l 3 7 L 胞外區(qū)的獲得及其原核表達載體的構(gòu)建?