IAPs mRNA異常表達(dá)在急性白血病中臨床意義的研究.pdf

1、急性白血病(acute leukemia，AL)是一種克隆性起源，多能干細(xì)胞或很早期的祖細(xì)胞(髓系或淋系)突變而引起的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。一般認(rèn)為，基因變異的不斷積累，可使細(xì)胞的生長、增殖、分化出現(xiàn)異常，導(dǎo)致白血病細(xì)胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻。凋亡受阻是急性白血病患者治療失敗的主要原因。近年來，國內(nèi)外研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，一系列凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)水平的異常與急性白血病發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有密切關(guān)系，其中某些能顯著影響AL患者臨床結(jié)局，可能成為危

2、險度分層和評價預(yù)后的指標(biāo)之一。 凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族是近年發(fā)現(xiàn)的一組具有抗凋亡活性的蛋白，通過抑制Caspase蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程中caspase-3、caspase-7、caspase-9及caspase前體(pro-caspase)的活性，調(diào)控Caspase級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的凋亡機(jī)制，參與細(xì)胞周期和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。越來越多證據(jù)表明，在包括急性白血病在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)

3、胞中可見IAPs(尤其XIAP及Survivin)表達(dá)上調(diào)；IAPs的表達(dá)陽性率及表達(dá)水平與AL的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系。 目前大部分研究集中于IAP家族中具體某一個成員與腫瘤預(yù)后的單因素分析。本研究采用RT-PCR半定量分析58例AL患者的IAP(包括XIAP、c-IAP1、c-IAP2和Survivin)的表達(dá)情況，觀察IAPs各成員在急性白血病中的表達(dá)與AL患者治療反應(yīng)的關(guān)系，初步評價它們對AL患者的臨床意義和預(yù)后指導(dǎo)作用。

4、 研究目的： 1、觀察急性白血病患者IAPs各成員的表達(dá)情況。 2、初步評價IAPs各成員的表達(dá)情況在急性白血病中的臨床意義。 材料與方法 研究對象 2006年5月～2008年1月在我科住院診治的新發(fā)或復(fù)發(fā)急性白血病患者58例，其中急性髓細(xì)胞白血病(AML)43例，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)15例，設(shè)10名健康體檢志愿者外周血標(biāo)本作對照組。 方法： 2.1分組設(shè)計(jì)

5、 將研究對象分為AL病例組(包括AML組和ALL組)、正常對照組，觀察各組中XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin mRNA的表達(dá)情況。根據(jù)XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin mRNA的表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組(以均值為界限)，分析IAPmRNA表達(dá)水平與臨床治療反應(yīng)和臨床特點(diǎn)的關(guān)系，比較IAP中各成員表達(dá)水平對AL患者化療CR率的影響。 2.2單個核細(xì)胞的分離和總RNA提取 標(biāo)本肝素抗

6、凝，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液(相對密度1.077)密度梯度離心法分離出單個核細(xì)胞，Trizol-異丙醇/氯仿法提取總RNA。總RNA經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，用核酸蛋白分析儀檢測其純度和濃度。 2.3半定量RT-PCR 2.3.1 cDNA合成 取RNA2μg經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，-20℃?zhèn)溆谩?2.3.2 PCR擴(kuò)增及IAPs半定量分析 設(shè)計(jì)合成引物，以cDNA為模板分別擴(kuò)增X

7、IAP、cIAP1、cIAP2、Survivin和內(nèi)參照β-actin的相應(yīng)基因序列片斷。PCR產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描成像，以XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin的吸光度與相應(yīng)的內(nèi)參照β-actin吸光度比值作為其mRNA的相對表達(dá)量，進(jìn)行半定量分析。2.3.3 PCR產(chǎn)物測序鑒定部分標(biāo)本的電泳條帶經(jīng)凝膠回收純化后進(jìn)行測序，將結(jié)果提交BLAST比對證實(shí)。 2.4患者臨床資料分析 分

8、析患者的臨床特點(diǎn)及治療反應(yīng)相關(guān)的信息，包括年齡、性別、AL亞型、初診時白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓/外周血原始細(xì)胞比例、髓外浸潤(如牙齦增生、淋巴結(jié)或肝脾腫大)、血清LDH水平、治療反應(yīng)(完全緩解/復(fù)發(fā)/難治)等。 2.5數(shù)據(jù)處理 SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用χ-±SD表示，組間表達(dá)水平的比較用t檢驗(yàn)和ANOVA檢驗(yàn)，組間表達(dá)率、緩解率的比較用卡方檢和Fisher精確概率檢驗(yàn)；非正態(tài)連續(xù)變量比較用秩和檢驗(yàn)。P<0

9、.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、總RNA的檢測 所提取的總RNA經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳在紫外透射儀上顯示有28S、18S兩條RNA帶，說明提取的RNA完整；核酸蛋白分析儀測得A260/A280為1.8～2.0之間，說明提取的RNA純度較好。 2 IAPs mRNA在AL中的表達(dá) 2.1 IAPs PCR產(chǎn)物電泳圖分析 被擴(kuò)增的XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin和內(nèi)

10、參照β-actin的基因序列片斷長度分別為247bp、281bp、327bp、276bp、156bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，在相應(yīng)位置觀察到均一的條帶。 2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序鑒定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后送測序，測序結(jié)果證實(shí)PCR擴(kuò)增所得的序列與Genebank所公布的目標(biāo)基因相應(yīng)序列均有較好的一致性。 2.3 IAPs mRNA相對表達(dá)水平的半定量檢測 2.3.

11、1 IAPs mRNA在AL中的表達(dá)情況 測定結(jié)果顯示，AL病例組的XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin mRNA的表達(dá)陽性率分別為91.4％(53/58)、74.1％(43/58)、75.9％(44/58)、94.8％(55/58)， 而相對表達(dá)水平分別是2.278±1.391.、0.9367±0.8490、0.8683±0.7458、1.190±0.7040，均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

12、05)：而AML組和ALL組之間則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。AL病例組中XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin全部都表達(dá)的例數(shù)為22例，占37.9％，其中AML組13例，ALL組9例。正常對照組則為0(0/10)，與病例組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2.3.2 AL亞型IAPs mRNA的表達(dá)觀察 比較AL亞型間IAPs mRNA的表達(dá)陽性率，未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異(P>0.05)。 3、IA

13、Ps mRNA相對表達(dá)水平的臨床意義分析 3.1 IAP表達(dá)量與療效關(guān)系 XIAP高表達(dá)組和Survivin高表達(dá)組患者2療程標(biāo)準(zhǔn)化療后CR率分別比低表達(dá)組低，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而cIAP1高表達(dá)組和cIAP2高表達(dá)組患者治療CR率分別較相應(yīng)的低表達(dá)組低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 進(jìn)一步比較XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin全部都表達(dá)的病例組與不全表達(dá)組患者治療C

14、R率，未能發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(59.1％vs 77.8％，P>0.05)。 3.2 IAPs表達(dá)與臨床特點(diǎn)關(guān)系 分別將XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin mRNA各高表達(dá)組與相應(yīng)低表達(dá)組的年齡、初診時血細(xì)胞計(jì)數(shù)、初診時骨髓/外周血原始細(xì)胞比例等臨床特點(diǎn)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)較之于XIAP低表達(dá)組，XIAP高表達(dá)組的骨髓原始細(xì)胞比例較高，初診時血紅蛋白水平較低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余各組則未發(fā)現(xiàn)

15、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。 結(jié)論： 1、 急性白血病患者XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin mRNA有較高表達(dá)水平，cIAP1、cIAP2 mRNA表達(dá)陽性率亦高于正常對照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AML組和ALL組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 2、XIAP高表達(dá)組、Survivin高表達(dá)組患者治療CR率明顯低于低表達(dá)組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示XIAP和Survivi