轉(zhuǎn)人B7-H3基因鱗癌細(xì)胞瘤苗誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的體外研究.pdf

1、目的： 腫瘤細(xì)胞提呈抗原給T細(xì)胞時(shí)，由于表面缺乏共刺激分子的表達(dá)，不能起始有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。為了將共刺激分子導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞以制備腫瘤疫苗，我們將表達(dá)B7-H3基因的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-B7-H3轉(zhuǎn)染入口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113中，檢測(cè)B7-H3基因在轉(zhuǎn)染口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113中的表達(dá)，進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)人B7-H3基因鱗癌細(xì)胞疫苗體外誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力。 方法： 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將真核表達(dá)質(zhì)粒pE

2、GFP-C1-B7-H3轉(zhuǎn)染入人鱗癌細(xì)胞Tca8113中，轉(zhuǎn)染24h,14d,30d后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，待轉(zhuǎn)染成功后，用RT-PCR檢測(cè)基因B7-H3在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)：用Western blot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定高表達(dá)克隆。以絲裂霉素C(MMC)處理后，制成腫瘤細(xì)胞疫苗，經(jīng)體外與人外周血淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)后，測(cè)定淋巴細(xì)胞特異性殺傷活性及對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響。 結(jié)果： 用

3、Lipofectamine2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒把pEGFP-C1-B7-H3載體轉(zhuǎn)入口腔鱗癌細(xì)胞株Tca8113中后，于24h、14d、30d時(shí)，在10x20倍倒置顯微鏡下用熒光觀察細(xì)胞(光波波長(zhǎng)488nm或513nm)，同時(shí)與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113做對(duì)照。轉(zhuǎn)染B7-H3的Tca8113細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞傳代培養(yǎng)后仍然能夠檢測(cè)到高表達(dá)的B7-H3基因，用Trizol從轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1-B7-H3的Tca8113細(xì)胞中

4、提取總RNA，然后用RT-PCR檢測(cè)B7-H3的表達(dá)，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約215bp，與預(yù)期的大小一致。轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1的Tca8113細(xì)胞中，沒(méi)有檢測(cè)到215bp的PCR產(chǎn)物。用Western blot方法抽提B7-H3/Tca8113基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，裂解已轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-B7-H3的Tca8113細(xì)胞(B7-H3/Tca8113)的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞膜蛋白中相對(duì)分子質(zhì)量約84～90KD大小的特異性條帶；而

5、mock/Tca811沒(méi)有特異性條帶。經(jīng)過(guò)G418篩選后挑取單克隆法建立了B7-H3/Tca8113細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染B7-H3的Tca8113細(xì)胞能夠高表達(dá)B7-H3蛋白。經(jīng)MMC處理后，與野生型的Tca8113細(xì)胞相比，上述瘤苗對(duì)T細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)顯示該基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)其體外增殖，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)Tca8113的特異性殺傷作用，能顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。 結(jié)論： 用脂質(zhì)體法把真核表達(dá)載體p

6、EGFP-C1-B7-H3轉(zhuǎn)染到口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113中，用挑選單克隆法建立了穩(wěn)定表達(dá)B7-H3蛋白的細(xì)胞株，用RT-PCR及Westernblot鑒定B7-H3基因在該細(xì)胞中有表達(dá)。B7-H3/Tca8113經(jīng)MMC處理后得到TCV-hB7-H3，將其與T細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)顯示該基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)其體外增殖，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)Tca8113的特異性殺傷作用，能顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。轉(zhuǎn)B7-H3基因人鱗